专利名称：一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种提高水稻根系发育和稻谷产量的基因、真核重组质粒及其制备方法与应用。
背景技术：
随着我国社会经济的快速发展，人均耕地逐年减少，粮食安全问题日益突出，水稻单产的进一步提高成为备受关注的重大课题。在水稻的高产育种理论上，20世纪90年代提出了塑造水稻新株型的理念(Dingkuhn M, et al. , 1991, Concepts for a new plant type fordirect seeded flooded tropical rice. International Rice Research Conference, 27-31)。按照这一概念，更高产的水稻品种集中表现为少蘖、大穗、矮秆和根系强壮这4个方面。水稻根系是植株吸收水分、营养物质和感受土壤环境的桥梁，又是氨基酸、多种激素等物质同化、合成的场所，根系状况直接影响着地上部分的生长发育及产量的形成， 是制约水稻产量潜力进一步发挥的关键因素。同时，根系的强壮与水稻抗倒伏能力、机械收割效率也有密切关系。但由于植物根系隐藏于地下，其发育的形态和生理学观察不易进行，相应分子机制的研究也较其他植物器官滞后。虽然，近年在双子叶模式植物拟南芥根的发育方面有了比较大的进展(Benfey PN, et al.，2010，Getting to the root of plant biology-impactof the Arabidopsis genome sequence on root research. Plant Journal, 61 :992-1000)，但由于单、双子叶植物根系的不同，如在拟南芥中有主根，然后顺序分生出侧根，而水稻、玉米等则是形成庞大而复杂的不定根系。所以，谷类作物还没有一套具体的根系形态、生理特征改良指标，对根系发育的分子调控机制也所知甚少。在已知的水稻根发育相关基因研究中，OsWOXII通过介导生长素、细胞分裂素的信号传递调控水稻不定根的生长发育，它的过量表达可以使不定根数量明显增加(aiao Y,etal. ,2009, The WUSCHEL-related homeobox gene WOXll is required to activate shoot-bornecrown root development in rice. Plant Cell, 21 :736-748) ；OsRMC 通过茉莉酸信号途径促进水稻根的发育、弯曲和卷曲(Jang J, et al. ,2007, RNAi knockdown of Oryza sativa root meandercur1ing gene led to altered root development and coiling which were mediated by jasmonic acidsignalling in rices. Plant, cell & Environment, 30 :690-699)。但总体来说，对于如何利用根系改良在水稻这种重要粮食作物的生产实践中克服水分、养分和气象条件限制，充分发挥水稻增产潜力，人们已发现和掌握的知识、技术手段还极为有限。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的基因、重组真核质粒及其制备方法，本发明的目的之二是将所述基因和真核重组质粒应用于促进水稻根系生长和提高稻谷产量。本发明的技术方案如下
利用生物信息学方法分析本发明所述提高水稻根系和稻谷产量的基因，预测其具有液泡ATP酶A亚基(Vacuolar H+_ATPase subunit Α)结构特征，命名为OsVHA。序列分析显示OsVHA基因的mRNA包含1863个碱基的开放阅读框，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO 1所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO 1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列。本发明所述真核重组质粒的制备方法，其特征在于制备步骤如下(1)在序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是位于起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒PSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK 中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。本发明所述真核重组质粒及其制备方法中，所述真核表达载体为pHB、 pCAMBIA1301、pTCK303 中的一种。将本发明所述重组质粒转化水稻，获得水稻转基因植株。实验表明所述转基因水稻植株可以促进水稻根系生长发育，使水稻的根长增加；与野生型水稻相比，转基因稻谷粒长、粒宽也增大，千粒重明显增加。因此，本发明所述的基因和真核重组质粒可在水稻根系发育和产量改良中应用。本发明具有以下有益效果1、本发明克隆了 OsVHA基因，并从该基因的核苷酸序列中选择了一段基因片段与真核表达载体构建真核重组质粒，为促进水稻根系生长发育和提高稻谷产量提供了一种新的基因资源和重组质粒制备方法，有利于水稻的增产增收。2、本发明所用的基因为水稻本身自有的基因，所以转基因水稻的安全性能高。3、本发明所述基因的克隆和水稻转基因均为常规方法，所需材料易于获取。
图1是本发明所述OsVHA基因的扩增产物电泳图。图中，M泳道分子量标记 (DL2000plus) ；1泳道0sVHA基因全长序列。图2是本发明所述真核重组质粒(pHB-VHARi)的结构示意图。其中，标注VHARi 为OsVHA基因选择片段。图3是转基因水稻植株中抗性筛选标记潮霉素抗性基因(HPT)的PCR扩增产物电泳图。图中，1泳道阳性对照，PCR模板为真核重组质粒pHB-VHARi ；2泳道阴性对照，PCR 模板为野生型水稻植株DNA ；3-8泳道PCR模板为转基因水稻阳性植株DNA。图4是转基因水稻阳性植株RT-PCR鉴定。图中，WT 野生型水稻植株；1泳道 pHB-VHARi转基因水稻1号植株(VHARi-I) ；2泳道pHB-VHARi转基因水稻2号植株 (VHARi-2) ；3 泳道pHB-VHARi 转基因水稻 3 号植株(VHARi_3)。
图5是pHB-VHARi转基因水稻谷粒生长情况。其中，A为野生型(WT)和1号转基因(VHARi-I)水稻谷粒照片；B、C、D分别为野生型(WT)和转基因(VHARi_l、VHARi-2, VHARi-3)水稻千粒重、粒长、粒宽统计结果。图6是pHB-VHARi转基因水稻植株根系生长情况。其中，A，B分别为野生型(WT) 和1号转基因(VHARi-I)水稻生长10天、60天时的生长情况；C为野生型(WT)和转基因 (VHARi-U VHARi-2, VHARi-3)水稻种子萌发后第6、8和10天时的根长统计结果。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 :0sVHA基因的克隆1、试剂与材料限制性内切酶、DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pMD18_T克隆载体等购自大连宝生物工程公司；PBLUNT-EASY克隆载体、质粒提取、DNA提取及DNA回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；RNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；反转录酶、反转录抑制剂购自Toyobo公司；大肠杆菌感受态制备试剂盒购自北京鼎国公司；PCR引物合成、测序由上海英骏生物公司完成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。大肠杆菌克隆菌株为E. coli JM109，购自Clontech公司。水稻野生型品种为日本晴，由实验室保存。2、培养基LB 培养基胰蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L。用 NaOH 调 pH 至 7. 0， 高压灭菌。SOB 培养基胰蛋白胨 20g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 0. 58g/L，KCl 0. 19g/L, 100 XMg2+ 10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。SOC 培养基S0B+20mM 葡萄糖。3、实验方法3. 1水稻RNA提取RNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司，RNA提取过程按照生产商建议程序进行。1)将50_100mg水稻叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μ L RL (使用前加入 β -巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混勻。在56°C孵育1-3分钟使水稻组织裂解；2)将所有溶液转移至过滤柱CS上，12000rpm离心5分钟，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中，洗头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；3)缓慢加入0. 5倍上清体积的无水乙醇，混勻，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心60秒，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；4)向吸附柱CS3中加入35(^1^去蛋白液1^1，12000印111离心60秒，弃去收集液， 将吸附柱CS3放回收集管中；
5) DNase I工作液的配置取10 μ L DNase I储存液于RNase-free离心管中，加入70 μ LRDD溶液，轻柔混勻；6)向吸附柱CS3中央加入80 μ L的DNase I工作液，室温放置15分钟；7)向吸附柱CR3加入35(^1^去蛋白液1^1，12000印111离心60秒，弃去收集液，将吸附柱CR3放回收集管中；8)向吸附柱CR3中加入500 μ L漂洗液RW (使用前加入乙醇)。室温静置2分钟， 12000rpm离心60秒，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；9)重复步骤8 ；10) 12000rpm离心2分钟，弃去收集液。将吸附柱CS3置于室温数分钟，彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free离心管，在柱的中央加入30-100 μ L 洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000rpm离心2分钟，洗脱RNA。RNA样品在_70°C中保存。3. 2RT-PCR3. 2. 1 第一链 cDNA 的合成1)取 1 μ g 总 RNA 与 1 μ L 25pmol oligo dT 引物混合，用 RNase-free ddH20 补足到12. 75 μ L，轻轻混勻；2) 65 0C保温5分钟，立即转移至冰浴中，放置2分钟；3)加入 5 X 反应缓冲液 4 μ L，IOmM dNTP 2 μ L, RNA 抑制剂 0. 25 μ L (40U/ μ L)， ReverTraAce 反转录酶 1 μ L (100U/μ L)，42°C保温 30 分钟，合成第一链 cDNA ；4) 95°C加热5分钟，失活反转录酶，终止合成反应。3. 2. 2PCR冰上在一个200 μ L EP管中加入以下组分
5 xPrimeStar Buffer10 (ΛdNTP Mixture(各2.5 mM )4 (ΛRT产物1 (ΛVHAF1 μLVHAR1 μLddH2032.5 μLPrimeStar0.5 μL按以下程序进行扩增:98°C 3min (预变性)；98°C IOs (变性)，57°C 15s (复性)， 72 0C 2min (延伸)，所述变性_复性_延伸30个循环；72 °C 5min (终延伸)。引物序列如下VHAF 5' -ATCGAGCGAGAGAGCCGTCT-3’VHAR 5' -GATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3’通过上述操作，获得2278bp水稻OsVHA基因全长序列。3. 3PCR产物和克隆载体pBLUNT-EASY载体连接
PCR产物与克隆载体pBLUNT-EASY载体连接，反应体系如下PCR 产物( 150 μ g/μ L)3. 5 μ LpBLUNT-EASY 载体1 μ L25 °C 连接 15 分钟。3. 4大肠杆菌转化3. 4. 1感受态细胞的制备大肠杆菌感受态制备试剂盒购自北京鼎国公司，制备过程按照生产商建议程序进行。1)接种大肠杆菌单菌落于2mL SOB培养液中，37°C过夜培养；2)转接0. 5mL过夜培养物至50mL SOB培养液中，18°C剧烈震荡18- 小时，至A_ 约为0. 55 ；3)将培养液转入50mL离心管中，冰浴10分钟，4°C 4000rpm离心10分钟；4)去上清，加入16mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，轻轻旋转，冰浴10分钟，然后 40C 4000rpm 离心 10 分钟；5)去上清，加入4mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，然后加入280 μ L DMS0，轻轻混勻， 冰浴10分钟；6)分装于预冷的1. 5mL EP管中，液氮中冻存。3. 4. 2 转化1)从液氮中取出一管大肠杆菌感受态细胞，冰浴解冻；2)将连接产物与感受态细胞轻轻混勻，冰浴30分钟；3) 42°C热激90秒，立即冰浴1_2分钟；4)加入0. 8mL的S0C，混勻，37°C温和振荡培养1小时。5)室温13000rpm离心1分钟，弃去部分上清液，留约200 μ L，用枪头将上清液与细胞混勻，涂布LB+Amp (50 μ g/mL)平板，37°C培养过夜。 3. 5细胞快速裂解法鉴定重组子1)挑取单个转化子接种于500 μ L含相应抗生素的LB培养液中，37°C振荡培养至 A600 为 0. 6-0. 8 ；2)取200 μ L菌液至0. 5mL EP管中，13000rpm离心1分钟，弃去大部分上清，留约 20μ L ；3)加入 20 μ L 的 2Χ 快速裂解液(0. 2mol/L NaOH 50mL, SDS 0. 5g，蔗糖 27. 2g， 加双蒸水至200mL)，剧烈振荡；4) 13000rpm 离心 15 分钟；5)取5 μ L上清直接进行琼脂糖凝胶电泳。与阴性对照相比，电泳带滞后的即可能是重组质粒。3. 6菌落PCR鉴定重组质粒经过快速裂解法鉴定的重组载体再进行菌落PCR以确定插入目标片段，反应体系及PCR程序如实施例1中3. 2. 2。对菌落PCR鉴定的重组载体进行测序，测序结果为序列表中SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。
实施例2 真核重组质粒的构建1、试剂与材料常规试剂与实施例1相同。用于转基因的农杆菌菌株为EHA105 (购自Clontech公司)；真核表达载体pHB由实验室保存。2、培养基与实施例1相同。3、方法3. IOsVHA基因片段的获得3. 1. IPCR根据SEQ ID NO=I所示核苷酸序列起始密码子下游1815bp至2152bp的基因片段设计构建真核重组质粒的引物如下VHARiFl :5’ -CTCGAGGATCCTGATGACCTCACAACCGGAT-3，VHARiRl :5，-AAGCTTGATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3，VHARiF2 :5’ -GAGCTCTGATGACCTCACAACCGGAT-3，VHARiR2 :5， -CTGCAGATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3，以VHARiFl和VHARiRl为正向扩增引物，以VHARiF2和VHARiR2为反向扩增引物， 按下面的PCR反应体系以及以下程序进行扩增预变性94°C %iin，变性94°C 30s，退火温度 58°C 20s延伸72°C 21s，所述变性-复性-延伸30个循环；72°C IOmin (终延伸)。
权利要求
1.一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.一种真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子。
3.根据权利要求2所述的真核重组质粒，其特征在于所述真核表达载体为pHB、 pCAMBIA1301、pTCK303 中的一种。
4.一种真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下(1)在序列表中SEQID NO :1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK 载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的PSK中间载体， 正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。
5.根据权利要求4所述的真核重组质粒的制备方法，其特征在于所述真核表达载体为 pHB、pCAMBIA1301、pTCK303 中的一种。
6.一种影响水稻根系发育的方法，其特征在于将上述2或3真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。
7.一种提高水稻产量的方法，其特征在于将上述2或3真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。
8.权利要求1所述基因在水稻根系发育和产量改良中的应用。
全文摘要
一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因及其应用，该基因具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。将SEQ ID NO1所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，获得本发明所述真核重组质粒。将上述真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。实验表明本发明所述SEQ ID NO1基因的下调能够促进水稻根系发育，提高水稻产量；与野生型水稻相比，转基因水稻的根长增加，谷粒明显增大粒重增加。因此，本发明所述的基因可在水稻根系发育和植株产量改良中应用。
文档编号A01H5/00GK102242136SQ20111010549
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者刘永胜, 张惠莹, 牛向丽 申请人:重庆大学