黑莓苗木的快速繁殖方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种黑莓苗木的快速繁殖方法。

背景技术：

黑莓(Rubus spp.Blackberry)是蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物。其果实成熟后，果实较大，呈紫红色，口感酸爽，且营养异常丰富，具有人体所必须的各种氨基酸、糖类和维生素，并且还含有大量的过氧化物歧化酶(SOD)，对人体免疫力的提高，血液凝固的促进，以及衰老的延缓等有着重要的作用。近代以来，随着果酒和罐头的投资发展，黑莓浆果独具有的果香和酸甜味道可以作为好原料，并且由于黑莓果营养价值高、保健作用明显，在国内外被称之为“黑钻石”，是目前备受关注的世界第三代新兴小果类果树，具有极高的经济价值和市场竞争力。

在19世纪的初期，黑莓的种植是在北美洲的大部分地区，20世纪80年代中期，江苏省中国科学院植物研究所对这些果树进行考察，将其优良品种于1986年引入我国。黑莓的优良品种具有较好的水土保持作用，并且耐干旱，耐盐碱，易栽培，近年来在我国发展十分迅速，在我国南方贫瘠丘陵山地种植面积不断扩大，深受当地农民的青睐，是他们发家致富的首选经济果树。

种植面积的增大，意味着苗木需求量的增加，因此短期获得大量健壮苗木是急需解决的问题。

技术实现要素：

本发明以黑莓品种朝植8号的茎段位外植体进行离体培养，对培养基中激素配比进行了研究，目的是挑选出适合黑莓品种朝植8号快速繁殖的方法，以此来获得大量的具有优良性状的黑莓植株。

本发明采用的技术方案是：黑莓苗木的快速繁殖方法，方法如下：

1)消毒灭菌：取长度为2-3cm且带有腋芽的黑莓茎段，进行消毒灭菌，得接种茎段；优选的，所述的消毒灭菌为：将长度为2-3cm且带有腋芽的黑莓茎段，用自来水冲洗，再用洗衣粉浸泡20分钟后，转入超洁净工作台，用体积分数75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3-4次，然后用体积分数0.1％的HgCl₂溶液浸泡8min，再用无菌水冲洗3-4次，用吸水纸吸干表面水分。

2)初代培养：以含30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基为基础，添加0.5-1.5mg/L的6-BA和0-0.2mg/L的NAA作为初代培养基，将经过消毒灭菌的接种茎段接种到初代培养基中，于温度25±2℃，光照时间15h/d，光照度3000lx，相对湿度70％的条件下培养。

优选的，所述的初代培养基中，添加1.0mg/L的6-BA。

3)继代培养：以含30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基为基础，添加0.5-2.0mg/L的6-BA或0.30-1.0mg/L的NAA作为继代培养基，将经过初代培养的接种茎段，从基部切下后分成单芽并接种到继代培养基中，于温度25±2℃、光照时间15h/d、光照度3000lx、相对湿度约70％的条件下培养。

优选的，所述的继代培养基中，添加1.0mg/L的6-BA或0.30mg/L的NAA。

4)生根培养：以含20g/L蔗糖和8g/L琼脂的1/2MS培养基为基础，添加0.05-1.00mg/L的NAA作为生根培养基，将经过继代培养的芽从基部切下，分成单芽后接入生根培养基中，于温度25±2℃、光照时间15h/d、光照度3000lx、相对湿度70％的条件下培养。

优选的，所述的生根培养基添加0.10mg/L的NAA。

上述的黑莓苗木的快速繁殖方法，所述的黑莓为黑莓朝植8号。

本发明的有益效果是：本发明在MS培养基的基础上，通过培养基成分激素配比的优化，获得黑莓朝植8号快速繁殖的培养基，以此来获得大量具有优良性状黑莓植株，通过本发明的方法繁殖植株可有效的缩短成苗培养周期，并且经过快速繁殖的植株生根数量较多且根较为粗壮，可大大的提高移栽成活率。

附图说明

图1是实施例2在1.00mg/L的6-BA的初代培养基上黑莓品种朝植8号茎段萌芽情况。

图2是实施例2在1.00mg/L的6-BA的初代培养基上黑莓品种朝植8号展叶情况。

图3是实施例2在1.00mg/L的6-BA的继代培养基上黑莓品种朝植8号不定芽增殖和芽长情况。

图4是实施例3在0.30mg/L的NAA的继代培养基上黑莓品种朝植8号不定芽增殖和芽长情况。

图5是实施例2在0.10mg/L的NAA的生根培养基外植体生根情况。

具体实施方式

实施例1 黑莓苗木的快速繁殖方法

1、消毒灭菌

选择生理状态相似的若干枝条，剪成长度为2-3cm并且带有腋芽的茎段，然后用自来水冲洗20分钟，再于适量的洗衣粉中浸泡20分钟后，转入超洁净工作台，用体积分数75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3-4次，然后用体积分数0.1％的HgCl₂溶液浸泡8min，再用无菌水冲洗3-4次，用吸水纸吸干表面水分，此茎段为接种茎段。

2、初代培养

以含有30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基(PH 5.8)为基本，如表1添加不同质量浓度的6-BA和NAA作为初代培养基，将经过消毒灭菌并修剪后的黑莓朝植8号外植体分别接种于初代培养基中，每个处理接种5瓶，每瓶接种3个茎段，并设置三次重复。置于温度(25±2)℃，光照时间15h/d，光照度3000lx，相对湿度70％的条件下培养。15d后统计萌芽率，并分别于接种后的第15d和第30d测量芽长，培养40d后统计增殖系数。

萌芽率＝(萌发腋芽的外植体数/接种的外植体数)×100％

增殖系数＝增值腋芽数/接种芽总数

平均芽长＝(分化芽总长/分化总芽数)×100％

生根率＝(生根芽数/接种芽总数)×100％

表1

由表1可见，在初代培养基中添加NAA不利于腋芽的萌发和生长，仅需添加适量的6-BA即可获得较好的培养效果。黑莓品种朝植8号带腋芽茎段在初代培养基添加了1.00mg/L的6-BA的MS培养基(含30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH 5.8)中萌芽率和增殖系数最高，并且长势最好，即15d和30d的平均芽长分别达到0.95cm和1.33cm。因此优选，初代培养基为以含30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基为基础，添加1.00mg/L的6-BA。

3、继代培养

以含30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基(pH 5.8)为基础，如表2，添加0.5-2.0mg/L的6-BA或0.30-1.0mg/L的NAA作为继代培养基，将经过初代培养的健壮不定芽，从基部切下后分成单芽并接种到继代培养基中，每处理接种5瓶，每瓶3个不定芽，各设置重复3次，于温度25±2℃、光照时间15h/d、光照度3000lx、相对湿度约70％的条件下培养，35d后统计不定芽的生长和增殖情况。

表2

由表2可以看出，在6-BA添加量为0.50、1.00和2.00mg/L的3组培养基中，在6-BA质量浓度为1.00mg/L的培养基上不定芽的增殖系数最高，达到3.67。随6-BA质量浓度的提高，平均芽长逐渐减小，在6-BA添加量为1.0mg/L的培养基上平均芽长最大，达到2.10cm。在NAA添加量为0.30、0.50和1.00mg/L的3组培养基中，NAA添加量为0.30mg/L时，不定芽增殖系数最高，达到1.79；并且在NAA添加量为0.30mg/L的培养基上不定芽的平均芽长最大，达到2.73cm。说明在增殖培养基中NAA添加量较高不利于不定芽的生长。因此，在黑莓品种朝植8号的继代培养基中，优选，添加质量浓度为1.00mg/L的6-BA，或添加质量浓度为0.30mg/L的NAA。

4、生根培养

以含20g/L蔗糖和8g/L琼脂的1/2MS培养基(pH 5.8)为基础，分别添加质量浓度为0.05、0.10、0.50和1.00mg/L的NAA作为生根培养基，将经过继代培养且长势较好的芽从基部切下，分成单芽后接入生根培养基中，每处理接种5瓶，每瓶接种3个芽，各重复3次。于温度25±2℃、光照时间15h/d、光照度3000lx、相对湿度70％的条件下培养，30d后观察生根情况。

实验结果：当NAA浓度为0.10mg/L时，外植体生根较快，生根多且壮，当NAA浓度为0.50mg/L时，外植体生根慢并且气生根较多，当NAA浓度为1.00mg/L时，外植体生根较慢，生根少但较长。因此，优选，生根培养基中添加0.10mg/L的NAA。

实施例2

1、消毒灭菌

选择生理状态相似的若干枝条，剪成长度为2-3cm并且带有腋芽的茎段，然后用自来水冲洗20分钟，再于适量的洗衣粉中浸泡20分钟后，转入超洁净工作台，用体积分数75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3-4次，然后用体积分数0.1％的HgCl₂溶液浸泡8min，再用无菌水冲洗3-4次，用吸水纸吸干表面水分，此茎段为接种茎段。

2、初代培养

以含有30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基(PH 5.8)为基础，添加1.0mg/L的6-BA作为初代培养基，将经过消毒灭菌并修剪后的黑莓朝植8号外植体分别接种于初代培养基中，每个处理接种5瓶，每瓶接种3个茎段，并设置三次重复。置于温度(25±2)℃，光照时间15h/d，光照度3000lx，相对湿度70％的条件下培养。培养4d后萌芽，12d后展叶，如图1和图2所示，结果显示，以黑莓品种朝植8号带腋芽茎段为外植体进行初代离体培养时，添加1.00mg/L 6-BA的MS培养基(含20g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH 5.8)较为适宜，芽的萌发和生长达到最好状态。

3、继代培养

以含30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基(pH 5.8)为基础，添加1.00mg/L的6-BA作为继代培养基，将经过初代培养的健壮不定芽，从基部切下后分成单芽并接种到继代培养基中，每处理接种5瓶，每瓶3个不定芽，各设置重复3次，于温度25±2℃、光照时间15h/d、光照度3000lx、相对湿度约70％的条件下培养。培养35d后，黑莓品种朝植8号不定芽在1.00mg/L 6-BA的继代培养基上的增殖和芽长情况，如图3所示，结果显示，以黑莓品种朝植8号不定芽为外植体进行继代离体培养，添加质量浓度为1.00mg/L的6-BA的MS继代培养基(含20g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH 5.8)时，平均芽长最长，且芽较为健壮，因此，此培养基的激素浓度最适合芽的生长和增殖。

4、生根培养

以含20g/L蔗糖和8g/L琼脂的1/2MS培养基(pH 5.8)为基础，添加0.10mg/L的NAA作为生根培养基，将经过继代培养且长势较好的芽从基部切下，分成单芽后接入生根培养基中，每处理接种5瓶，每瓶接种3个芽，各重复3次。于温度25±2℃、光照时间15h/d、光照度3000lx、相对湿度70％的条件下培养。培养30d后，黑莓品种朝植8号外植体在0.10mg/LNAA的生根培养基的生根情况如图5所示，结果显示，以以黑莓品种朝植8号不定芽为外植体进行生根培养时，添加0.10m g/LNAA的1/2M S培养基(含20g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH 5.8)更为合适，此浓度下的培养基生根快，根多且较粗壮，对生根有着一定的促进作用。

实施例3

1、消毒灭菌：方法同实施例2

2、初代培养：方法同实施例2

3、继代培养

以含30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基(pH 5.8)为基础，添加0.30mg/L的NAA作为继代培养基，将经过初代培养的健壮不定芽，从基部切下后分成单芽并接种到继代培养基中，每处理接种5瓶，每瓶3个不定芽，各设置重复3次，于温度25±2℃、光照时间15h/d、光照度3000lx、相对湿度约70％的条件下培养。培养35d后，黑莓品种朝植8号不定芽在0.30mg/LNAA的继代培养基上的增殖和芽长情况，如图4所示，结果显示，以黑莓品种朝植8号不定芽为外植体进行继代离体培养，添加质量浓度为0.30mg/L的NAA的MS继代培养基(含20g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH 5.8)时，不定芽的增殖系数最高，并且平均芽长最长，最适合芽的生长和增殖。

4、生根培养：方法同实施例2。培养30d后，黑莓品种朝植8号外植体在0.10mg/LNAA的生根培养基中进行生根培养，生根快，根多且较粗壮。