本发明属于害虫生物防治技术领域，具体涉及一种利用宿主种群内各家系对不同微生物敏感性差异互补控制斜纹夜蛾的方法。
二、技术背景
昆虫病原微生物是害虫生物防治的重要组成部分，主要包括细菌、真菌及病毒等，一些病原微生物可在自然环境下调节害虫的种群数量。昆虫对病原微生物表现出丰富的表型多样性，这种多样性受宿主遗传异质性大小的影响。病原微生物在遗传异质性低的宿主种群比遗传异质性高的宿主种群中更易流行，后者对病原微生物的敏感性更为多样化(Elton 1958，Leonard 1969，Hamilton 1987，Sherman et al.1988，Schmid-Hempel 1998)。宿主种群遗传异质性高可减慢病原微生物的流行，但这也受病原微生物株系影响(Boomsma and Ratnieks，1996；Van Baalen and Beekman，2006)。在大型水蚤中，发现病原微生物的流行水平与种群遗传多样性和病原微生物株系多样性均相关，在所有宿主种群中，病原微生物株系多样性越丰富，其在宿主种群中流行水平越高。在遗传多样性丰富低的宿主种群中，当受多种病原微生物侵染时，较遗传性低的宿主种群，其流行水平更低(Ganz等，2010)。
然而关于病原微生物在昆虫种群中的流行受宿主遗传异质性和寄生物株系多样性影响的研究仅局限于大型水蚤等少数昆虫中，并且也主要关注宿主种群间遗传异质性以及同类寄生物多种株系间差异，对许多农业重大害虫病原微生物流行与宿主种群遗传异质性及不同类别微生物关系等还未有报道，更没有合理利用它们进行害虫控制的有效方法。而当前杀虫微生物在生产上的应用普遍存在控害效果不高的问题，揭示重大农业害虫种群内各家系或种群间与杀虫微生物敏感性差异等关系，不仅能够丰富害虫与杀虫微生物协同进化理论，还可以获得合理有效利用杀虫微生物进行害虫防控的方法，提升害虫生物防治水平。
斜纹夜蛾属鳞翅目夜蛾科害虫，其食性杂、食量大、繁殖力强，近年来在我国不少地区常暴发成灾，给蔬菜生产造成严重损失。已发现自然界中斜纹夜蛾可感染斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltNPV)等病毒(任彬元等，2014)，也发现其还可以感染莱氏野村菌等真菌(钟万芳等，2015)。比较研究斜纹夜蛾同一种群内不同家系对杀虫真菌莱氏野村菌、杀虫细菌粘质沙雷氏菌以昆虫病毒敏感性，以了解害虫种群内不同家系对微生物敏感性的差异是否一致，可明确害虫与杀虫微生物的协同进化策略，同时也为合理高效利用害虫对不同杀虫微生物敏感性差异提供依据，对于创新和高效利用杀虫微生物防治农业重大害虫至关重要。
三、
技术实现要素：
1、发明目的
提供一种利用宿主种群内各家系对不同微生物敏感性差异互补控制斜纹夜蛾的方法，能有效提高杀虫微生物的控害效果，提升害虫的生物防治水平。
2、技术方案
为达到上述目的，本发明选用能侵染害虫的细菌、真菌和病毒等不同类微生物，比较分析其对害虫种群内不同家系的致病力，明确各类微生物对害虫不同家系致病力是否存在差异，且差异是否不同，利用宿主种群内各家系对微生物敏感性差异互补，筛选对各家系致病力最高的微生物种类，组合它们控制害虫。
本发明为一种利用宿主种群内各家系对不同微生物敏感性差异互补控制斜纹夜蛾的方法，其特征在于利用莱氏野村菌、粘质沙雷氏菌和斜纹夜蛾核型多角体病毒对斜纹夜蛾各家系敏感性差异的互作来控制斜纹夜蛾，提升害虫生物防治水平。
3、有益效果
本发明的方法与现有技术相比，产生以下有益效果：与当前单种杀虫微生物控制害虫相比，有效地提升了害虫生物防治水平。
四、具体实施方式：
本发明的实施例是采用室内生物测定方法。
供试材料
斜纹夜蛾：斜纹夜蛾A、B和C三个家系为斜纹夜蛾安徽和县种群中通过单对配对所建立，在室内用人工饲料进行继代饲养。饲养条件：温度为27±1℃，光周期14L：10D，虫卵用2％甲醛消毒，幼虫在3龄前群体饲养，3龄后单独饲养。
粘质沙雷氏菌：本实验室内保存，于2012年8月从江苏省南京市田间采集自然感病的褐飞虱中分离。在超净台上用灭菌挑针挑取菌落单一的粘质沙雷氏菌放置无菌水中，并稀释成不同浓度，用移液枪吸取100μl菌液至在LB(胰蛋白胨1％，氯化钠1％，酵母提取物0.5％，琼脂2％)培养基上，采取涂板的方法进行培养。在温度为25±1℃的恒温箱中培养，待48h平板上形成完整典型菌落后，挑取不同单孢菌落中心移至新的LB培养基上进一步分离纯化和扩大培养，备用。
莱氏野村菌：由罹病斜纹夜蛾幼虫虫体上分离得到，用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养，备用。
斜纹夜蛾核型多角体病毒：SpltNPV和县株从安徽和县田间感染斜纹夜蛾中分离出，室内在斜纹夜蛾幼虫中繁殖，病毒多角体纯化后放于4℃冰箱备用。
试验方法
莱氏野村菌分生孢子液的制备：将分生孢子粉刮到一个三角瓶中，加入10mL的0.05％吐温-80及少量的玻璃珠，充分振荡后过滤，除去菌丝和杂质。利用血球计数板计数法，把分生孢子配成实验需要的108孢子/ml悬浮液。
粘质沙雷氏菌液的配制：在超净台中用已灭菌的挑针刮取已纯化培养好的粘质沙雷氏菌平板，加少量无菌水制成原液，显微镜下用血球计数板计数，然后将原液稀释至浓度为107cfu/ml的菌液。
斜纹夜蛾核型多角体病毒多角体悬浮液的配制：将在斜纹夜蛾活体上繁殖的SpltNPV经差速离心，获得纯化多角体，加无菌水配成原液，显微镜下用血球计数板计数，然后将原液稀释至5×106pIB/ml悬浮剂。
生物测定：采用饲料喂毒法进行生物测定。将大小一致的斜纹夜蛾3龄幼虫置于六孔板中，每孔1头，每孔中加入一块体积为64立方毫米的正方体人工饲料，用移液器将20μL真菌液或10μL病毒液或10μL细菌液加入饲料上，同时设有清水对照组，每处理10个板，每两板为一个重复。置于温度为27±1℃和光周期为14L：10D的光照培养箱中进行饲养，每天定时观察，记录各板的病死和非病死虫数。
应用SPSS软件对杀虫微生物作用后的致死率进行统计分析。
实施例
分别比较研究了斜纹夜蛾3个家系对杀虫细菌粘质沙雷氏菌、杀虫真菌莱氏野村菌以及斜纹夜蛾核型多角体病毒的敏感性。发现三个家系对同种微生物的敏感性不同，但这种敏感性差异因微生物不同而异。斜纹夜蛾3个家系对108孢子/ml莱氏野村菌的敏感性存在差异，家系A的死亡率为23.3％，显著高于家系B(8.3％)，但与家系C无显著差异(F2，14＝4.294，P＝0.039)。3个家系对107cfu/ml粘质沙雷氏菌的敏感性同样有显著差异，家系A，B和C的死亡率分别为13.3％、20％和10％，其中对家系B的死亡率显著高于家系C，而与家系A无显著差异(F2，14＝4.308，P＝0.039)。3个家系对5×106PIB/ml斜纹夜蛾核型多角体病毒的敏感性也存在显著差异，其中以家系C最敏感，害虫的死亡率高达93.3％，显著高于家系C的死亡率(55％)，与家系A无显著差异(F2，14＝8.667，P＝0.005)。
综合斜纹夜蛾种群内三个家系对不同微生物的敏感性，可看出对真菌、细菌和病毒的敏感性最高的家系分别为家系A、B和C，要实现对害虫的高效控制，需利用宿主种群内各家系对不同微生物敏感性差异互补，筛选出对各家系致病力最高的微生物组合控制害虫。因此，利用莱氏野村菌、粘质沙雷氏菌和斜纹夜蛾核型多角体病毒来组合控制斜纹夜蛾，可提升害虫生物防治水平。
表1斜纹夜蛾不同家系对三种微生物的敏感性比较
注：同一行数字后相同字母表示5％水平上无显著差异。