本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种珍稀兰科名贵药材铁皮石斛蒴果及种子的长期保存方法。
背景技术：
铁皮石斛是兰科(Orchidaceae)石斛属多年生附生兰。《中国药典》(2010版)将铁皮石斛作为单列药材品种，明确其基源植物为兰科植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，其干燥茎或新鲜茎药用(国家药典委员会，2010)。铁皮石斛含有多糖、芪类、生物碱、氨基酸和微量元素等多种成分，具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖和养阴生津等多种生物活性(李玲等，2011)。
目前关于铁皮石斛组织培养所采用的外植体主要是种子、茎段、根尖、幼芽、叶片等，通过上述外植体先诱导原球茎，然后生产组培苗的方式居多，占76％以上(范俊安等，1999；杜刚等，2007)，而这些原球茎的获得有80％是以种子为外植体诱导的(金银兵，2009；李荣珍，2012)。所以真正在生产上大规模使用的外植体是种子，相比其他的繁殖方式，种胚产生原球茎的增殖途径是丛芽增殖方式的数十倍，对铁皮石斛的快速繁殖具有重要意义(蒋慧萍，2009；冯耀文等，2013)。通过茎段、根尖、叶片诱导类原球茎的方式，不适合大规模的生产，类原球茎繁殖多代后，分化成苗的潜力降低。
采用种子作为外植体，从种子播种到形成可以移栽的幼苗需要6-8个月的时间。铁皮石斛果实的成熟期一般在10月下旬至11月上旬。铁皮石斛蒴果以成熟未开裂前采收最好，种子易采收及消毒，且发芽率高。若等到果实成熟开裂时采收，不仅种子难以收集与消毒，且种子发芽率降低。将果实放入4℃的冰箱中保存，保存时间也不能超过1个月，否则易发霉腐烂或降低发芽率(蒋慧萍，2009)。因此在进行工厂化生产时，如何保存果实或种子，如何根据供苗时间自主地选择种子的播种时间就显得格外重要。关于铁皮石斛种子的保存，仅见张治国等(1997)、王君晖等(1999)的干冻法保存，即通过硅胶脱水后的种子，不经过玻璃化保护剂PVS2处理，在液氮中保存24小时或1个月，种子萌发率为92％-95％，与未经冷冻的种子的萌发率一致。在石斛属的其他种类中，Renato等(2014)报道了石斛杂交种“Dong Yai”的成熟种子放入PVS2溶液中处理1-3小时，再投入液氮中保存60分钟后取出，进行种子萌发实验。结果表明种子的萌发率最高为58％，流式细胞分析表明冷冻保存的种子萌发产生的幼苗没有发生染色体的变化。
上述研究中，种子保存时间最长的为1个月，并且要使用液氮，对于一般的企业操作起来不是很方便，因此研究经济、有效的铁皮石斛果实或种子的保存方法尤为重要，这不仅对于种质资源的保存有重要意义，而且可以做到取材不受季节影响，有利于工厂化种苗的生产。
上文中涉及的参考文献如下：
1、杜刚,杨海英,朱绍林等.铁皮石斛种子诱导成苗试验.中药材,2007,30(10):1207-1208；
2、范俊安,张艳,李泉森,等.铁皮石斛种子培养试验研究.重庆中草药研究,1999,(40):48-49；
3、国家药典委员会.中华人们共和共药典.北京:中国医药科技出版社,2010；
4、冯耀文,李泽生,耿秀英,等.铁皮石斛组培苗工厂化生产技术关键问题探讨.热带农业科技,2013,36(3):30-32；
5、蒋慧萍,庾韦花,张向军,等.铁皮石斛种子胚培养的产业化研究.江苏农业科学,2009,(2):72-75；
6、金银兵.铁皮石斛的生物学特性与开花授粉技术研究.安徽农业科学,2009,37(11):5280-5282；
7、李玲,邓晓兰,赵兴兵,等.铁皮石斛化学成分及药理作用研究进展.肿瘤药学,2011,1(2):90-94；
8、李荣珍.铁皮石斛种子试管苗的快速繁殖研究.广东农业科学,2012,(14):22-24.
王君晖,张毅翔,刘峰,等.铁皮石斛种子、原球茎和类原球茎体的超低温保存研究.园艺学报,1999,26(1):59-61；
9、张治国,刘骅,夏志俊,等.铁皮石斛种子的超低温保存研究.安徽中医学院学报,1997,16(5):40-41；
10、Galdiano Jr R F,de Macedo Lemos E G,de Faria R T,et al.Seedling development and evaluation of genetic stability of cryopreserved Dendrobium hybrid mature seeds.Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,172(5):2521-2529.(玻璃化冻存的石斛属杂交成熟种子的幼苗发育及遗传稳定性评价.应用生物化学和生物技术,2014,172(5):2521-2529.)。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种铁皮石斛蒴果/种子的长期保存方法，本发明利用现代生物技术，提高铁皮石斛蒴果或种子的保存时间，既能满足长期保存(可保存至少半年～1年)的需要，同时又能保证种子具有高的萌发率，使人们能够根据供苗时间自主地选择种子的播种时间。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种铁皮石斛蒴果/种子的长期保存方法，将收获的铁皮石斛果实分成完整果实(未开裂果实)和开裂果实，对完整果实依次进行以下步骤：
1.1、果实消毒：
完整果实依次经酒精表面擦拭、酒精浸泡、无菌水冲洗、升汞灭菌、无菌水冲洗后，用无菌滤纸上吸干表面水分；
1.2、果实的脱水处理：
用滤纸包裹步骤1.1所得的无菌蒴果后一起放入密封袋中，并且在密封袋内放入用于吸湿的硅胶；每隔2～3天更换一次硅胶，直至硅胶的蓝色不再发生变化为止，得脱水后蒴果；
1.3、对步骤1.2所得的脱水后蒴果进行水分含量的检测；
当脱水后蒴果中的种子的含水量≤10％时，进行下述步骤1.4；
当脱水后蒴果中的种子的含水量＞10％时，返回至步骤1.2继续进行脱水处理；
1.4、将被滤纸包裹的果实放入密封袋中，且在密封袋中装有硅胶；所述脱水后蒴果的个数与密封袋中的硅胶的重量比为30个/100～150g；
将至少一个的密封袋放入密封容器中，且在密封容器装有硅胶；所述脱水后蒴果的个数与密封容器中的硅胶的重量比为60个/200～250g；
将整个密封容器置于-80℃～-20℃保存。
作为本发明的铁皮石斛蒴果/种子的长期保存方法的改进：
所述步骤1.1为：
将完整果实先用体积浓度为65～75％(较佳为70％)的酒精进行表面擦拭，然后在无菌环境(例如为超净工作台)中，用体积浓度为65～75％(较佳为70％)的酒精浸泡上述擦拭后果实，浸泡时间为30～60秒；接着用无菌水冲洗，再用质量浓度0.1％升汞(100ml上述升汞中加3～5滴吐温)灭菌10～12分钟，无菌水冲洗干净后，置于无菌滤纸上吸干水分。
作为本发明的铁皮石斛蒴果/种子的长期保存方法的改进：
所述步骤1.2为：
将无菌蒴果每30～50个放入长、宽各为30cm的滤纸(预先高压灭菌，烘干备用)内，用棉纱线捆好，形成滤纸袋，将滤纸袋放入自封袋中，在自封袋中放入硅胶，使硅胶盖住滤纸袋，室温放置；前3天每天更换一次硅胶，第4天起每2天更换一次，直至硅胶的蓝色不再发生变化为止(此过程一般需要7-10天)。
作为本发明的铁皮石斛蒴果/种子的长期保存方法的改进：
对开裂果实依次进行以下步骤：
2.1、果实的消毒：
将开裂果实用体积浓度为65～75％(较佳为70％)的酒精进行表面擦拭；
2.2、果实的脱水处理：
在平底容器中加入硅胶，在硅胶上铺一层滤纸，切开步骤1)所得的消毒后果实，倒出果实内的种子并平铺在滤纸上，将平底容器密封；每2～3天更换一次硅胶；直至硅胶的蓝色不再发生变化为止，得脱水后种子；
2.3、对步骤2.2所得的脱水后种子进行水分含量的检测；
当脱水后种子的含水量≤10％时，进行下述步骤2.4；
当脱水后种子的含水量＞10％时，返回至步骤2.2继续进行脱水处理；
2.4、将脱水后种子装入密封管(例如为离心管)，直至占密封管容积的50±5％，在密封管内的剩下空间放置被滤纸包裹的硅胶从而实现密封填充；
然后将至少一个的整个密封管装入内设硅胶的密封袋中，所述脱水后种子与密封袋中的硅胶的用量比为1g/20-50g；
最终将整个密封袋置于-80℃～-20℃保存。
备注说明：需要使用种子时，用含0.5％-0.75％有效氯的次氯酸钠溶液(每100ml内加2～3滴洗洁精)消毒灭菌10-15分钟，然后将种子连同灭菌剂一起倒入装有无菌滤纸的漏斗中(预先高压灭菌，烘干后备用)，用无菌水充分冲洗至没有次氯酸钠味道。再将滤纸撕成1-2厘米的滤纸片，将有种子的一面贴在培养基上培养。
作为本发明的铁皮石斛蒴果/种子的长期保存方法的改进：所述步骤2.2中，种子为单层平铺在滤纸上。
在本发明中，铁皮石斛蒴果在10月下旬或11月上旬采收，即，铁皮石斛果实成熟尚未开裂时收获果实，如果部分果实开裂，也及时收获；然后经挑选后分成完整果实、开裂果实这2类，分别采用各自不同的保存方法。
种子含水量的测定(此为常规技术)：超净工作台上，打开滤纸包装，随机抽取一个果实，剥开果皮，将种子取出，称重，放入105℃烘干的放在干燥器中冷却的称量瓶(称量瓶重量要预先称量)中进行称重，然后将称量瓶放入105℃烘箱中烘至重量不再减少时，测定种子中的含水量，种子的含水量％＝[(烘干前种子和称量瓶的重量-烘干后种子和称量瓶的重量)/烘干前种子的重量]*100。
在本发明中，种子活力的测定和种子萌发实验：分别于保存6个月和1年的蒴果或种子进行种子活力测定和萌发实验。
蒴果内种子活力的测定：
蒴果由于是无菌的，直接在超净台上取出蒴果，放入无菌培养皿中，切去头部，将部分种子抖落在铺有滤纸的9厘米培养皿内，上面再盖一层滤纸，然后加入无菌水，盖上皿盖，放在25℃的培养室中，吸涨培养16小时后，将无菌水去掉，加入0.5％TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)法(pH 6.7)放置于30℃的摇床中暗培养24小时后，置于生物显微镜下检查种子活力。用移液枪吸取混匀的种子置于载玻片上，随机选择5个视野，进行统计。胚被染上红色的种子为有生活力的种子。种子的生活力(％)＝(胚被染上红色的种子/所检测的种子数)*100。
种子的萌发培养：
将其余种子抖落在1/2MS+土豆80g/l+NAA 0.2mg/l+白砂糖25g/l的培养基中萌发。
开裂的蒴果的种子先灭菌：将种子取出部分，放入15毫升离心管，种子量约到离心管1毫升刻度处，加入有效氯浓度为0.5％-0.75％的次氯酸钠溶液(内加2-3滴洗洁精)9-10毫升，盖上试管盖，上下颠倒摇晃灭菌10-15分钟，然后将种子连同灭菌剂一起倒入装有无菌滤纸的漏斗中，用无菌水充分冲洗，将滤纸放入12厘米灭菌的培养皿中，用刀和镊子配合，将滤纸撕成1-2厘米的滤纸片，取一片带有种子的滤纸放入9厘米的带有滤纸的培养皿中，在滤纸片上再覆盖一层滤纸，然后加入无菌水，吸涨培养16小时后，然后同上述种子活力的测定。
种子萌发：将其它滤纸片有种子的一面在培养基表面上贴，种子就转移到培养基表面，然后将滤纸片取出。
常规技术中，新鲜果实采收后放4℃冰箱，只能保存一个月，在保存的过程中，容易发霉，导致种子的损失；蒴果容易开裂，造成消毒的不彻底以及随保存时间的延长，种子的活力降低等不利因素。而本发明的铁皮石斛成熟未开裂的果实先消毒再干燥后冷冻保存的方式，能延长种子的保存时间，并且能维持种子高的活力和萌发率。
本发明的从开裂果实(种子发育较老)中取出种子，干燥后再冷冻保存。实际需要使用种子时，用有效氯浓度为0.5％-0.75％的次氯酸钠溶液消毒后接种，既可以消毒种子，又可以腐蚀种皮，促进种子的萌发。常规的果实室温干燥，再冷冻保存的方式，容易导致果实的开裂，造成日后培养时消毒的困难，并且果皮与种子混杂在一起，也容易造成消毒的不彻底，导致种子培养时的污染。
本发明的优点：操作简单、方便，所需要的仪器设备简单；保存时间长，种子活力高，萌发率高。本发明的研究结果有效地解决了铁皮石斛果实和种子的长期保存，使企业能够根据自身的发展需要，随时取材播种，不受季节的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、铁皮石斛蒴果的保存方法，铁皮石斛蒴果在10月下旬采收，选择未开裂的果实(即，完整果实)，依次进行以下步骤：
1)、果实消毒：
蘸取70％(体积％)酒精棉球进行果实表面擦拭，然后转移到超净工作台，将果实用70％的酒精浸泡30秒，无菌水冲洗1次，然后用含0.1％(质量％)升汞(每100mL0.1％升汞加3～5滴吐温20)灭菌10min，无菌水冲洗干净后，置于无菌滤纸上吸干水分。
吐温20，即，TWEEN-20(上海生工生物工程有限公司，AMRESCO分装)。
2)、果实的脱水处理：
将步骤1)所得的无菌蒴果每30个放入灭过菌的正方形滤纸(30厘米*30厘米)中包好，用棉纱线扎紧从而形成滤纸袋，然后放入自封袋中，在自封袋中放入硅胶(约250g)，使硅胶盖住滤纸袋，室温放置。前3天每天更换一次硅胶，第4天起每2天更换一次，第7天时(此时硅胶的蓝色不再发生变化)在超净工作台上对脱水后蒴果进行水分含量的检测；
3)、打开滤纸袋，随机抽取一个果实，剥开果皮，将种子取出，进行种子含水量的测定。种子的含水量％＝[(烘干前种子和称量瓶的重量-烘干后种子和称量瓶的重量)/烘干前种子的重量]*100。经过7天的硅胶干燥，种子的含水量为8.3％。
4)、将装有30个果实的滤纸包放入加有150g硅胶的自封袋中，将2个自封袋放入塑料饭盒中，在饭盒的四周撒入一些硅胶(250g)，盖上盒盖密封后，置于-80℃或-20℃的冰箱中保存备用。
保存6个月后，-80℃冰箱中保存的种子活力为97.6％，-20℃冰箱保存的种子活力平均为93.5％；种子萌发率-80℃冰箱中保存的种子萌发率平均为93.6％，-20℃冰箱保存的种子萌发率平均为91.8％。
保存1年后，-80℃冰箱中保存的种子活力为96.8％，-20℃冰箱保存的种子活力平均为92.0％；种子萌发率-80℃冰箱中保存的种子萌发率平均为94.3％，-20℃冰箱保存的种子萌发率平均为90.4％。
实施例2、一种铁皮石斛种子的保存方法，铁皮石斛蒴果在10月下旬采收，从收获的铁皮石斛果实挑出开裂果实；对开裂果实依次进行以下步骤：
1)、果实的消毒：
将开裂果实用70％(体积％)的酒精进行表面擦拭；
2)、果实的脱水处理：
在直径15厘米的大培养皿内倒入100克的硅胶，在硅胶上面铺一层12厘米大小的方形滤纸，将上述表面擦拭消毒后的果实切开，将种子抖落在培养皿的滤纸上，直至整个滤纸上有薄薄的一层种子。然后用保鲜膜将培养皿的上下盖接触处密封好，置于室温下，每2天更换一次硅胶，4天后，结束此脱水处理(此时，硅胶不再变色)。
3)、4天后，随机抽取少量种子进行含水量的测定，种子的平均含水量为8.2％。
4)、将干燥好的种子分装到15毫升的离心管中，装入总容量的一半(种子的重量约在1.01g～1.15g)，然后将9cm大小的滤纸装入4g左右的硅胶，用细线绑成滤纸包，塞入离心管中，从而将离心管的剩余空间密封。将5个离心管置于自封袋中，自封袋中加入约200g的硅胶，置于-80℃或-20℃的冰箱中保存。
保存6个月后，分别将-80℃和-20℃冰箱中存放的种子取出部分，放入15毫升离心管，种子量约到离心管1毫升刻度处，加入有效氯浓度为0.5％的次氯酸钠(内加2～3滴洗洁精)溶液10毫升，盖上试管盖，上下颠倒摇晃灭菌15分钟，然后将种子连同灭菌剂一起倒入装有无菌滤纸的漏斗中，用无菌水充分冲洗，将滤纸取下放入12厘米灭过菌的培养皿中，用刀片和镊子将滤纸撕成1-2厘米的滤纸片，一张滤纸片加入蒸馏水吸涨培养16小时后进行种子活力测定，其余的滤纸片接入培养基中进行萌发实验。
结果保存6个月后，-80℃冰箱中保存的种子活力为94.7％，-20℃冰箱保存的种子活力平均为91.6％；种子萌发率-80℃冰箱中保存的种子萌发率平均为91.2％，-20℃冰箱保存的种子萌发率平均为88.5％。保存1年后，-80℃冰箱中保存的种子活力为93.5％，-20℃冰箱保存的种子活力平均为92.5％；种子萌发率-80℃冰箱中保存的种子萌发率平均为90％，-20℃冰箱保存的种子萌发率平均为85.3％。
对比例1-1、相对于实施例1而言，减少脱水处理的时间(即，脱水时间由7天改成4天)，第4天时进行种子的含水量测定，此时种子的含水量维持在15％，其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1的步骤4)改成以下内容：将装有30个果实的滤纸包直接放入塑料饭盒中，盖上盒盖密封后，置于-80℃或-20℃的冰箱中保存备用。即，取消了自封袋(及其自封袋中的硅胶)、塑料饭盒中的硅胶的使用，其余等同于实施例1。
对比例1-3、将实施例1的步骤4)改为：将装有30个果实的滤纸包和硅胶400g直接混合后放入塑料饭盒中；其余等同于实施例1。
将上述对比例1-1～对比例1-3所得的种子，按照实施例1所述方法进行检测，不同保存温度、时间下对应的种子活力、萌发率如下表1所述。
表1、不开裂蒴果不同对比例处理的种子活力和萌发率比较
对比例2-1、相对于实施例2而言，减少脱水处理的时间，2天后进行含水量的测定，从而控制种子的含水量为15％。其余等同于实施例2。
对比例2-2、取消实施例2步骤4)中的自封袋中的硅胶的使用，其余等同于实施例2。
将上述对比例2-1～对比例2-2所得的种子，按照实施例2所述的方法进行检测，不同保存温度、时间下对应的种子活力、萌发率如下表2所述。
表2、开裂蒴果不同对比例处理的种子活力和萌发率比较
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。