本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种通过红茶菌消减枸杞中有机磷农药毒死蜱残留的方法。
背景技术：
：枸杞是我国西北地区的主要栽培经济植物，是适合于经济林、水土保持林、生态林等的多用途树种。西北地区因其独特的高海拔、强光照的地理特点及土壤和气候条件，特别适合枸杞生长，出产的枸杞鲜果玲珑剔透，红艳欲滴，状似红宝石，色红粒大，籽少、肉厚、糖分高，大小均匀，品质优良，颇受市场欢迎。枸杞作为西北地区特色产业，发展日趋壮大。由于西北地区生态多样性较低，病虫害天敌未能形成强大种群，故随着种植规模不断扩大，病虫害日益增多，农药施用必不可少。农药的实际利用率往往很低，因为能够真正用于杀虫、杀菌的农药只占所用农药量的10％～20％，而大量过剩农药则直接落于土壤中，或以微粒形式融于空气中。因此，枸杞产品中农药残留成为食品安全隐患，并直接降低枸杞产品品质和枸杞产业效益。有机磷农药有品种多、药效高、应用范围广、成本低等优点，在我国是用量最多、范围最广的农药，使用量占农药总量的80％～90％。毒死蜱(Chlorpyrifos)是一种高效、广谱、中等毒性的有机磷类杀虫剂，具有良好的触杀、胃毒和熏蒸作用，广泛用于防治多种作物上的螟虫、粘虫、介壳虫、蚜虫、棉铃虫、蓟马、叶蝉和螨类等害虫。随着高效高毒农药(如甲胺磷、水胺硫磷等)的禁用，毒死蜱逐渐代替高效高毒农药，使用范围越来越广，用量越来越大，并已成为防治枸杞病虫害的重要农药。因此，消减毒死蜱在枸杞产品中的残留对于提升枸杞品质和保障食品安全具有重要意义。微生物降解法以其作用温和、降解产物对环境污染小等优点成为消减农药残留的有效策略。酯酶由于其底物适应的广泛性，对有机磷、有机氯、菊酯、氨基甲酸酯等类农药均有降解作用。许多微生物均能产生酯酶，将具有产酯酶活性的酵母、醋酸菌和乳酸菌共生培养成微生态稳定的红茶菌，可望开拓出食品级安全、降解效率高且能够持久起作用的农药残留消减策略。技术实现要素：本发明提供一种通过红茶菌消减枸杞中有机磷农药残留的方法，将红茶菌发酵液喷施到结果期的枸杞植株上以及土壤中，发挥红茶菌所产酯酶降解有机磷农药毒死蜱残留的效力。一种通过红茶菌消减枸杞中有机磷农药残留的方法，包括以下步骤：1)将SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分别制成菌悬液；2)将SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌悬液、AcetobacterspCICC20441菌悬液和LactobacillusplantarumCICC23165菌悬液混合加入含蔗糖的茶汁中，静置培养，形成菌膜后即为红茶菌发酵成熟，得到红茶菌发酵液；3)有机磷农药毒死蜱施药后，将红茶菌发酵液喷洒到结果期的枸杞植株上以及土壤中，从而消减枸杞中有机磷农药毒死蜱残留。本发明中，SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165三者共生而长成红茶菌过程中，所产酯酶活力持续增长，形成菌膜后，红茶菌发酵成熟，酯酶持久维持高活力。本发明中，红茶菌产生对人体无害而对有机磷农药毒死蜱具有降解作用的酯酶，能够消减毒死蜱残留。步骤1)中，SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；菌种保持编号分别为CICC33068、CICC20441和CICC23165。将SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分别制成菌悬液，包括：出发密度均为106～107cfu/mL，接种量均为1％～5％，将SaccharomycescerevisiaeCICC33068接种至YPD液体培养基，将AcetobacterspCICC20441接种至AC液体培养基，将LactobacillusplantarumCICC23165接种至MRS液体培养基，均在33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为108～109cfu/mL的菌悬液。所述的接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。进一步优选，将SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分别制成菌悬液，包括：出发密度均为106～107cfu/mL，接种量均为2％～3％，将SaccharomycescerevisiaeCICC33068接种至YPD液体培养基，将AcetobacterspCICC20441接种至AC液体培养基，将LactobacillusplantarumCICC23165接种至MRS液体培养基，均在33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为108～109cfu/mL的菌悬液。所述的YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：该培养基的pH值调节至6.5～7.5。所述的AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：该培养基的pH值调节至6.4～7.2。所述的MRS培养基，以1L计，包括以下组分：该培养基的pH值调节至6.0～6.6。进一步优选，所述的YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：该培养基的pH值调节至6.5～7.5。所述的AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：该培养基的pH值调节至6.4～7.2。所述的MRS培养基，以1L计，包括以下组分：该培养基的pH值调节至6.0～6.6。步骤2)中，所述的含蔗糖的茶汁的制备包括：将红茶茶叶添加到沸水中，煮沸后过滤，得到茶汁，茶汁中加入蔗糖溶解，灭菌，冷却后，得到含蔗糖的茶汁。所述的红茶茶叶的质量与沸水的体积之比为0.5g～2g：100mL，进一步优选，所述的红茶茶叶的质量与沸水的体积之比为1g：100mL，即将红茶茶叶以1％的浓度添加到沸水中。所述的蔗糖的质量与茶汁的体积为30g～80g：1L，所述的蔗糖的质量与茶汁的体积为50g：1L，即茶汁中按50g/L的浓度加入蔗糖溶解。将SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌悬液、AcetobacterspCICC20441菌悬液和LactobacillusplantarumCICC23165菌悬液按照体积比1：1：1混合加入含蔗糖的茶汁中。所述的静置培养为在20～30℃静置培养10天～20天。所述的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌悬液与含蔗糖的茶汁的体积比为1～3：100。所述的AcetobacterspCICC20441菌悬液与含蔗糖的茶汁的体积比为1～3：100。所述的LactobacillusplantarumCICC23165菌悬液与含蔗糖的茶汁的体积比为1～3：100。进一步优选，所述的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌悬液与含蔗糖的茶汁的体积比为2：100。所述的AcetobacterspCICC20441菌悬液与含蔗糖的茶汁的体积比为2：100。所述的LactobacillusplantarumCICC23165菌悬液与含蔗糖的茶汁的体积比为2：100。步骤3)中，所述的红茶菌发酵液的喷洒量与结果期的枸杞植株的数目之比4～6升：9株，所述的结果期的枸杞植株在土地上的密集程度为7～11株枸杞/16米2土地。进一步优选，所述的红茶菌发酵液的喷洒量与结果期的枸杞植株的数目之比5升：9株，所述的结果期的枸杞植株在土地上的密集程度为9株枸杞/16米2土地。与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明通过混合培养，使SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165三者共生而长成微生态稳定的红茶菌，有机磷农药毒死蜱施药后，将红茶菌发酵液喷洒到结果期的枸杞植株上以及土壤中，发酵液中的酯酶发挥对有机磷农药毒死蜱残留的降解作用，发酵液中的红茶菌在枸杞植株和土壤中定殖并继续自然发酵，持久产生酯酶。红茶菌产生对人体无害而对有机磷农药毒死蜱具有降解作用的酯酶，能够消减毒死蜱残留。具体实施方式实施例11)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出发密度为106～107cfu/mL，分别接种至液体培养基(YPD培养基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至6.5。AC培养基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸钙20.0g，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至6.4。MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，吐温801.0mL，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至6.0。)中，接种量为1％，37℃振荡培养24h，得到菌悬液，菌液密度分别为108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；菌种保持编号分别为CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)将红茶茶叶以1％的浓度(w/v，即茶叶的质量与沸水的体积之比为1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八层纱布过滤，得到茶汁，茶汁中按50g/L的浓度加入蔗糖溶解，121℃灭菌20min，冷却至室温25℃后，得到含蔗糖的茶汁，分别按照占茶汁1％(v/v)的比例，同时接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌悬液、AcetobacterspCICC20441菌悬液和LactobacillusplantarumCICC23165菌悬液，室温25℃静置培养10d，三者共生而长成红茶菌过程中，所产酯酶活力持续增长，形成菌膜后，红茶菌发酵成熟，酯酶持久维持高活力。在枸杞结果期，有机磷农药毒死蜱施药后，按照4升/9株枸杞16米2土地的用量喷洒红茶菌发酵液，红茶菌通过其磷酸酯酶活力降解毒死蜱。红茶菌在发酵过程中，随着其酯酶活力增长，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味着红茶菌在土壤中定殖。3)经过步骤1)和步骤2)的处理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱开始被降解(见表1)。毒死蜱测定：按照GB/T23200-2008，采用气相色谱-质谱法。酯酶活力测定：以p-硝基苯月桂酸盐(p-nitrophenyllaurate，p-NPL)为底物，测定p-NPL的水解度，以每分钟水解1μmolp-NPL为1个酯酶活力单位，具体技术细节参照“Fucinosetal.JBiotechnol,2005,117,233-241.”。表1(试验：红茶菌喷施；对照：等量茶汁喷施)毒死蜱浓度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(试验)0.1450.1120.0960.0770.0450.0290.023根周土壤(试验)0.2650.2130.1860.1440.0870.0490.028枸杞(对照)0.1390.1240.1030.0970.0860.0680.055根周土壤(对照)0.2780.2550.2180.1850.1650.1560.137磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(试验)36.535.733.837.032.229.831.5根周土壤(试验)39.944.346.544.640.939.542.7枸杞(对照)2.22.52.32.92.72.62.8根周土壤(对照)6.07.37.07.48.47.87.7试验中，通过红茶菌喷施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率达到84.1％，土壤中毒死蜱降解率达到89.4％，分别比对照高23.7和38.7个百分点，说明红茶菌对毒死蜱降解有明显促进作用。表1还显示，红茶菌喷施后，枸杞上和土壤中酯酶活力极显著地高于对照且保持稳定，说明红茶菌通过产生酯酶而发挥对毒死蜱降解有明显促进作用。实施例21)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出发密度为106～107cfu/mL，分别接种至液体培养基(YPD培养基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至7.5。AC培养基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸钙20.0g，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至7.2。MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，吐温801.0mL，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至6.6)中，接种量为5％，37℃振荡培养24h，得到菌悬液，菌液密度分别为108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；菌种保持编号分别为CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)将茶叶以1％的浓度(w/v，即茶叶的质量与沸水的体积之比为1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八层纱布过滤，茶汁中按50g/L的浓度加入蔗糖溶解，121℃灭菌20min，冷却至室温25℃后，分别按照占茶汁3％(v/v)的比例，同时接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌悬液、AcetobacterspCICC20441菌悬液和LactobacillusplantarumCICC23165菌悬液，室温25℃静置培养10d以上，三者共生而长成红茶菌过程中，所产酯酶活力持续增长，形成菌膜后，红茶菌发酵成熟，酯酶持久维持高活力。在枸杞结果期，有机磷农药毒死蜱施药后，按照6升/9株枸杞16米2土地的用量喷洒红茶菌发酵液，红茶菌通过其酯酶活力降解毒死蜱。红茶菌在发酵过程中，随着其酯酶活力增长，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味着红茶菌在土壤中定殖。3)经过步骤1)和步骤2)的处理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱开始被降解(见表2)。毒死蜱测定与酯酶活力测定同实施例1。表2(试验：红茶菌喷施；对照：等量茶汁喷施)毒死蜱浓度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(试验)0.1560.1210.0950.0820.0560.0300.021根周土壤(试验)0.2250.1730.1440.1200.0830.0450.025枸杞(对照)0.1400.1250.1060.0900.0780.0650.053根周土壤(对照)0.2680.2400.2060.1760.1590.1450.133磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(试验)44.545.643.038.333.533.832.5根周土壤(试验)42.040.547.739.643.639.342.5枸杞(对照)3.23.43.94.32.92.92.6根周土壤(对照)7.57.86.66.46.46.56.8试验中，通过红茶菌喷施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率达到86.5％，土壤中毒死蜱降解率达到88.9％，分别比对照降低24.4和38.5个百分点，说明红茶菌对毒死蜱降解有明显促进作用。表2还显示，红茶菌喷施后，枸杞上和土壤中酯酶活力极显著地高于对照且保持稳定，说明红茶菌通过产生酯酶而发挥对毒死蜱降解有明显促进作用。实施例31)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出发密度为106～107cfu/mL，分别接种至液体培养基(YPD培养基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至7.0。AC培养基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸钙20.0g，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至6.8。MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，吐温801.0mL，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至6.3)中，接种量为2％，37℃振荡培养24h，得到菌悬液，菌液密度分别为108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；菌种保持编号分别为CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)将茶叶以1％的浓度(w/v，即茶叶的质量与沸水的体积之比为1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八层纱布过滤，茶汁中按50g/L的浓度加入蔗糖溶解，121℃灭菌20min，冷却至室温25℃后，分别按照占茶汁2％(v/v)的比例，同时接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌悬液、AcetobacterspCICC20441菌悬液和LactobacillusplantarumCICC23165菌悬液，室温25℃静置培养10d以上，三者共生而长成红茶菌过程中，所产酯酶活力持续增长，形成菌膜后，红茶菌发酵成熟，酯酶持久维持高活力。在枸杞结果期，有机磷农药毒死蜱施药后，按照5升/9株枸杞16米2土地的用量喷洒红茶菌发酵液，红茶菌通过其酯酶活力降解毒死蜱。红茶菌在发酵过程中，随着其酯酶活力增长，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味着红茶菌在土壤中定殖。3)经过步骤1)和步骤2)的处理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱开始被降解(见表3)。毒死蜱测定与酯酶活力测定同实施例1。表3(试验：红茶菌喷施；对照：等量茶汁喷施)毒死蜱浓度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(试验)0.1440.1090.1030.0850.0600.0380.010根周土壤(试验)0.2350.1880.1550.1180.0800.0530.015枸杞(对照)0.1320.1150.0960.0820.0730.0610.059根周土壤(对照)0.2550.2330.2030.1800.1560.1420.138磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(试验)34.835.533.038.735.532.537.3根周土壤(试验)40.542.244.538.543.043.742.6枸杞(对照)4.34.04.92.73.33.03.6根周土壤(对照)6.56.76.97.47.46.57.8试验中，通过红茶菌喷施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率达到93.1％，土壤中毒死蜱降解率达到90.6％，分别比对照降低27.8和44.7个百分点，说明红茶菌对毒死蜱降解有明显促进作用。表3还显示，红茶菌喷施后，枸杞上和土壤中酯酶活力极显著地高于对照且保持稳定，说明红茶菌通过产生酯酶而发挥对毒死蜱降解有明显促进作用。实施例41)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出发密度为106～107cfu/mL，分别接种至液体培养基(YPD培养基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至7.0。AC培养基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸钙20.0g，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至6.8。MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，吐温801.0mL，水定容至1000mL；该培养基的pH值调节至6.3)中，接种量为3％，37℃振荡培养24h，得到菌悬液，菌液密度分别为108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；菌种保持编号分别为CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)将茶叶以1％的浓度(w/v，即茶叶的质量与沸水的体积之比为1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八层纱布过滤，茶汁中按50g/L的浓度加入蔗糖溶解，121℃灭菌20min，冷却至室温25℃后，分别按照占茶汁2％(v/v)的比例，同时接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌悬液、AcetobacterspCICC20441菌悬液和LactobacillusplantarumCICC23165菌悬液，室温25℃静置培养10d以上，三者共生而长成红茶菌过程中，所产酯酶活力持续增长，形成菌膜后，红茶菌发酵成熟，酯酶持久维持高活力。在枸杞结果期，有机磷农药毒死蜱施药后，按照5升/9株枸杞16米2土地的用量喷洒红茶菌发酵液，红茶菌通过其酯酶活力降解毒死蜱。红茶菌在发酵过程中，随着其酯酶活力增长，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味着红茶菌在土壤中定殖。3)经过步骤1)和步骤2)的处理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱开始被降解(见表4)。毒死蜱测定与酯酶活力测定同实施例1。表4(试验：红茶菌喷施；对照：等量茶汁喷施)毒死蜱浓度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(试验)0.1290.0880.0720.0600.0480.0330.010根周土壤(试验)0.2440.1950.1600.1240.0980.0630.023枸杞(对照)0.1420.1270.1180.0930.0880.0670.055根周土壤(对照)0.2590.2300.1920.1740.1590.1480.135磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(试验)33.635.033.938.935.337.537.0根周土壤(试验)43.642.944.647.938.540.541.1枸杞(对照)4.24.65.34.74.35.04.6根周土壤(对照)6.86.96.37.57.27.17.5试验中，通过红茶菌喷施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率达到92.2％，土壤中毒死蜱降解率达到90.6％，分别比对照降低30.9和42.7个百分点，说明红茶菌对毒死蜱降解有明显促进作用。表4还显示，红茶菌喷施后，枸杞上和土壤中酯酶活力极显著地高于对照且保持稳定，说明红茶菌通过产生酯酶而发挥对毒死蜱降解有明显促进作用。当前第1页1 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