一种定量检测葡萄糖系列酸及内酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种定量检测葡萄糖系列酸及内酯的方法，具体涉及高效液相色谱对 红茶菌发酵产生的葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸与葡萄糖二酸-1，4-内酯(DSL)的分 离检测，属于分离检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 红茶菌在发酵过程中，红茶培养液中的葡萄糖被醋酸菌氧化为葡萄糖酸类及乙酸 等代谢产物，其中葡萄糖酸类包括葡萄糖一酸，逐步转化为葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸、葡萄 糖二酸-1，4-内酯。
[0003] 葡萄糖醛酸是人体肝脏中最主要的解毒物质之一，可与外源的毒素或人体代谢产 生的内源有毒物质相结合，变成水溶性的葡萄糖苷酸，并一起排出体外，从而使可能引起身 体各种病变的或已经发生病变的毒素被及时清除，起到防病和治病的良好效果;葡萄糖二 酸及其衍生物葡萄糖二酸-1，4-内酯能够有效抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，通过参与人体 代谢活动调节体内激素环境发挥化学防癌作用，预防和有效抑制如食道癌、结肠癌、激素依 赖性癌症乳腺癌、肝癌、皮肤癌和膀胱癌等病症;葡萄糖二酸-1，4-内酯还具有很强的解毒 和抗氧化性能，它可以抑制胰岛辟田胞凋亡减轻四氧嘧啶(ALX)诱导的糖尿病，缓解盐酸伊 立替康(CPT-11)引起的肠道黏膜损伤。
[0004] 国内外学者对葡萄糖系列酸及内酯的分离检测也有不少研究，主要集中在葡萄糖 二酸、葡萄糖二酸-1，4-内酯、葡萄糖醛酸中其中一种或两种的检测分离。检测方法主要有 高效液相色谱法和气相色谱法，其中气相色谱法对于样品前期处理过程相对繁杂，检测效 率较低;高效液相色谱法主要采用C18柱和SB-Aq色谱柱，该方法前处理简便、灵敏度高、检 测效果较好。但同时检测分离葡萄糖一酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸与葡萄糖二酸-1，4-内 酯的方法国内外未见报道，因此，目前需要探索一种新型、简便、高效的分离方法把这四种 葡萄糖系列酸及内酯进行有效的分离测定，切实解决目前存在的葡萄糖酸分离不开、检测 不出、方法繁杂、无法定量等问题，推动红茶菌发酵饮料产业的发展。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，本发明针对目前由葡萄糖衍生而成的葡萄糖系列酸及其内酯 在分离过程中存在的缺陷和局限性，提供了一种能够定性、定量检测葡萄糖一酸、葡萄糖醛 酸、葡萄糖二酸与葡萄糖二酸1，4-内酯的方法。本发明前处理简便、灵敏度高、测定组分多， 不仅能有效的分离检测这四种葡萄糖酸及内酯，还能对其进行定量分析，对于提高检测工 作效率、控制红茶菌生产质量和提高功能因子产量，具有重要的意义。
[0006] 本发明提供的一种定性或定量检测葡萄糖一酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸与葡萄 糖二酸1，4_内酯的方法，是先通过SB_Aq色谱柱对样品中的匍萄糖二酸-1，4_内酯直接进行 定性或定量分析，若检测结果显示样品中不含葡萄糖二酸-1，4-内酯，则通过氨基色谱柱对 样品中的葡萄糖一酸、葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸直接进行定性或定量分析;若SB-Aq色谱柱 检测结果显示含有葡萄糖二酸-1，4-内酯，则通过氨基色谱柱对样品中的葡萄糖醛酸和葡 萄糖二酸直接进行定性或定量分析，再通过这4种化合物的总量计算分析得到样品中葡萄 糖一酸的含量。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述方法中利用SB-Aq色谱柱进行检测的色谱条件 是:厶8丨161^58-六9色谱柱（4.6111111\250111111，5以111)，流动相为？!12.5的0.025111〇1/11〇12?04，流 速0.3-0.7mL/min(最佳为0.5mL/min)，柱温25~30°C(最佳为30°C)，进样量10yL，紫外检测 波长为210nm〇
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述SB-Aq色谱条件条件下，葡萄糖一酸、葡萄糖二 酸、葡萄糖醛酸的保留时间接近，但三者均与葡萄糖二酸-1，4-内酯得到较好的分离。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述SB-Aq色谱条件条件下，葡萄糖一酸、葡萄糖二 酸、葡萄糖醛酸的保留时间均在5.20-6. Omin，而葡萄糖二酸-1，4-内酯保留时间为6.7-7. lmin;葡萄糖二酸-1，4-内酯的回归方程y = 1.0 X 106x-81382，相关系数R为0.9998。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述方法利用氨基色谱柱进行检测的色谱条件是： YMC-Pack Polyamine Π 氨基色谱柱，流动相为含有乙腈10%的80~120mM/L磷酸二氢铵溶 液（最佳为l〇〇mM/L)，流速为0.4~1. OmL/min(最佳0.5mL/min)，柱温25~30°C(最佳为30 °C)，进样量25yL，紫外检测波长210nm〇
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述氨基色谱柱色谱条件下，葡萄糖一酸和葡萄糖 二酸-1，4-内酯的保留时间接近，而葡萄糖二酸和葡萄糖醛酸均能够与葡萄糖一酸和/或葡 萄糖二酸-1，4-内酯分离。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述氨基色谱柱色谱条件下，葡萄糖醛酸的回归方 程y = 1 · 3 X 106x+19744，相关系数R为0·9997;葡萄糖二酸的回归方程y = 4·3 X 105x+lll 13， 相关系数R为〇. 9995;葡萄糖二酸-1，4-内酯的回归方程y = 1.6 X 106x-4.4 X 105，相关系数R 为0.9998;葡萄糖一酸的回归方程y = 1.4 X 106x-2.7 X 105，相关系数R为0.9998。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述样品是红茶菌的发酵液。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述样品是将红茶菌的发酵菌液去除菌体、蛋白类 大分子物质后收集得到的滤液。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明的方法通过利用SB-Aq色谱柱与氨基色谱柱联合检测，对混合样品中葡萄 糖系列酸及内酯(葡萄糖一酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸与葡萄糖二酸1，4-内酯)进行定性、 定量检测，克服了目前存在的葡萄糖酸分离不开、检测不出、方法繁杂、无法定量等问题，推 动红茶菌发酵饮料产业的发展。本发明的方法简便、高效、灵敏准确、精密度、稳定性好。
【附图说明】
[0017]图1是葡萄糖一酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸、葡萄糖二酸-1，4-内酯混合标准品的 氨基柱色谱图；1是葡萄糖二酸，2是葡萄糖一酸和葡萄糖二酸-1，4-内酯的混合，3是葡萄糖 醛酸。
[0018] 图2是葡萄糖一酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸、葡萄糖二酸-1，4-内酯混合标准品的 的SB-Aq色谱图；1是葡萄糖一酸、二酸、醛酸的混合，2是葡萄糖二酸-1，4-内酯。
[0019] 图3是红茶发酵液的SB-Aq色谱图；1是葡萄糖一酸、二酸、醛酸混合，2是葡萄糖二 酸-1，4-内酯。
[0020] 图4是红薯发酵液的SB-Aq色谱图；1是葡萄糖一酸、二酸、醛酸混合，2是葡萄糖二 酸，4_内酯。
[0021] 图5是红薯发酵液的氨基柱色谱图；1是葡萄糖二酸，2是葡萄糖一酸、葡萄糖二酸-1，4-内酯混合，3是葡萄糖醛酸。
【具体实施方式】
[0022] 实施例l:SB_Aq色谱柱和氨基色谱柱联合检测混合样品中葡萄糖系列酸及内酯 [0023]通过以下方法实现：
[0024] ⑴分别用流动相0 · 025mol/L KH2P〇4(pH2 · 5)溶液配制葡萄糖一酸、葡萄糖醛酸、 葡萄糖二酸钙和葡萄糖二酸-1，4-内酯标准样品各5mg/mL，经0.22μπι微孔滤头过滤后，4个 标品各取500yL混合，即浓度为1.25mg/mL的混合标准品，分别进行高效液相色谱测定。采用 Agilent SB_Aq色谱柱（4 · 6mm X 250mm，5μηι)，色谱条件：流动相为0 · 025mol/L KH2PO4 (pH2.5)，流速0.5mL/min，柱温30°C，进样量10yL，紫外检测波长为210nm。在此检测条件下， 葡萄糖一酸、葡萄糖二酸、葡萄糖醛酸的保留时间接近，但三者均与葡萄糖二酸-1，4-内酯 能够得到较好的分离(图1)。
[0025] (2)分别用流动相中100mM/L磷酸二氢铵溶液配制葡萄糖一酸、葡萄糖醛酸、葡萄 糖二酸钙和葡萄糖二酸-1，4-内酯标准样品各5mg/mL，pH为弱酸性，经0.22μπι微孔滤头过滤 后，4