双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法。

背景技术：

大多数植物的根系能与共生真菌建立共生，其对植物获取养分和发育至关重要。在北方和温带的森林中，最常见的根际共生是外生菌根（ectomycorrhizae,ecm），例如双色蜡蘑（laccariabicolor），即寄主植物的根和某些担子菌和子囊菌物种的菌丝之间的一种动态关系。真菌菌丝侵染寄主树的侧根（lateralroot,lr）顶端并形成ecm，这一种新的复合器官，是两个共生体之间互惠互作的场所。

一些ecm由以下部分组成：（1）广泛的可探测土壤的基质外菌丝网络；（2）一层聚集的菌丝即菌丝鞘在细根周围形成鞘状的储藏室；（3）哈氏网，生长在表皮和皮层细胞之间的菌丝网络，是营养物质和碳水化合物交换的场所。ecm菌根形成包括寄主植物中一系列复杂的发育过程，包括新侧根的形成，寄主植物中的表皮细胞径向扩展，根毛衰减，以及根冠减小。总之，这些形态变化导致ecm的短根表型的特征，而在形态上的准确变化因寄主植物而异。

双色蜡蘑（laccariabicolor）菌褶浅紫色至暗色，干后色变浅，直生至稍延生，等长，厚，宽，边沿稍呈波状。秋季生针阔混交林地上，群生或散生。而杨树是阔业落叶乔木,有主干,少旁枝,可作木料和生物能源用,或观赏,由于生命力强，还可以用作种植防护林带。随着世界上对将来可再生能源的需求会越来越大，对杨树的繁殖扩陪和大规模种植的研究越来越多，于是相应地，杨树和双色蜡蘑的共生机制研究也越来越深入。这样迫切需要建立一种培养系统，以方便观察研究，如可以方便组织切片﹑用激光共聚焦等观察哈氏网（hartignet）﹑容易提取两者的交换物质，以及有利于无污染地从生物组织提取rna﹑dna及蛋白质，该共生系统的建立对深入研究其共生的分子机制具有重要应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法的技术方案。

所述的双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）杨树插枝培养：杨树插枝在含有吲哚丁酸的ms培养基中培养5-7天，再转移到不含任何激素的ms培养基中培养直至杨树插枝底部形成2-3cm的根；

2）双色蜡蘑培养：将外生菌根真菌双色蜡蘑接种至覆盖在p5培养基上的赛璐玢薄膜上培养直至长出菌丝；

3）共生培养：将步骤1）得到的杨树插枝转移至覆盖在p20培养基上的赛璐玢薄膜上，再取步骤2）得到的带有双色蜡蘑的赛璐玢薄膜面朝下或朝上放在根上，用透气的胶带密封培养皿，用不透光材料遮盖根系部分，然后在24℃,16h光照，8h无光照的条件下培养1-3星期，即可得到共生体系。

所述的双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法，其特征在于所述的步骤1）中含有吲哚丁酸的ms培养基中含有：宏量元素50ml/l，微量元素100ml/l，葡萄糖1.0g/l，维生素10ml/l，iba溶液2ml/l，琼脂粉10g/l，所述的iba溶液浓度为1mg/ml，所述的宏量元素含有硫酸镁3.6mg/ml，硝酸钾38mg/ml，磷酸二氢钾3.4mg/ml，所述的微量元素含有硼酸62ug/ml，氯化钴0.25ug/ml，硫酸铜0.25ug/ml，edta钠盐373ug/ml，硫酸亚铁278ug/ml，硫酸锰169ug/ml，硫酸锌86ug/ml，所述的维生素含有肌醇10.0mg/ml，烟酸0.1mg/ml，吡哆醇0.1mg/ml，硫胺素1.0mg/ml。

所述的双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法，其特征在于所述的步骤2）中p5培养基含有：麦芽糖5g/l，酒石酸铵0.5g/l，kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，葡萄糖1.0g/l，营养液1.0ml/l，维生素b11.0ml/l。

所述的双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法，其特征在于所述的步骤1）中p20培养基中含有：酒石酸铵0.5g/l，kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，葡萄糖1.0g/l，营养液1.0ml/ml，维生素b11.0ml/l，mes钠盐1g/l，琼脂20g/l，用0.25mol/l的koh溶液调ph至5.8。

所述的双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法，其特征在于所述的营养液含有铁离子6.0mg/ml，锌离子2.0mg/ml，铜离子0.6mg/ml，锰离子5.0mg/ml，硼酸8.0mg/ml。

通过本发明建立的系统能够方便观察研究，如可以方便组织切片﹑用激光共聚焦等观察哈氏网（hartignet）﹑容易无污染提取两者的小分子交换物质，以及有利于无污染地从生物组织提取rna﹑dna及蛋白质，该共生系统的建立对深入研究其共生的分子机制具有重要应用价值。

本发明具有以下有益效果：

1.通过本发明建立的共生体系易于观察、追踪、拍照和分析根系菌根的发育。

2.根能与之前单独生长在赛璐玢膜上的外生菌根真菌直接或间接接触，并且在此培养期间可以观察菌根的发育情况。

3.间接接触允许信号分子互换，同时避免了两个物种间的直接接触，从而如果需要从一个生物提取rna/dna/蛋白质，则提取物就不会被另一个生物组织污染。

4.将一种吸附介质（双层，3×4cm赛璐玢膜）被运用到植物和真菌之间，能够吸附，提取和分析两种生物之间交换的分子。

附图说明

图1为双色蜡蘑接种于赛璐玢膜的示意图；

图2为杨树和双色蜡蘑菌根的菌根共生体系图；

图3为激光共聚焦观察杨树和双色蜡蘑共生菌根的荧光染色冷冻切片；

图4菌根真菌rna提取的浓度和质量（rqi）。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：杨树插枝的培养

（1）ms培养基的制备；每升培养基中宏量元素50毫升（宏量元素含有硫酸镁3.6mg/ml，硝酸钾38mg/ml，磷酸二氢钾3.4mg/ml），微量元素100毫升（微量元素含有硼酸62ug/ml，氯化钴0.25ug/ml，硫酸铜0.25ug/ml，edta钠盐373ug/ml，硫酸亚铁278ug/ml，硫酸锰169ug/ml，硫酸锌86ug/ml），葡萄糖1克，维生素10毫升（维生素含有肌醇10.0mg/ml,烟酸0.1mg/ml，吡哆醇0.1mg/ml，硫胺素1.0mg/ml），iba溶液2毫升。混合这些元素，调节ph至5.5，加琼脂粉10克，灭菌121°c，20分钟。冷却后，倒入培养皿，备用。

其中iba溶液的制备：称iba50mg于离心管中，滴加几滴100%的乙醇溶液使其溶解，加超纯水至50ml。在无菌工作台上用22um的过滤器过滤，等分并置于暗处4℃下保存，使用前15min从冰箱拿出（iba在低温下会结晶）。

（2）杨树外植体的移植

用试管中培养好的大约10cm长的杨树，将其从试管中拿出并将其放在无菌的砖上（经过高压灭菌的，整个操作过程是在层流工作台中进行）。剪去所有叶子并在节间剪取大约1-2cm作外植体。

将大约25个杨树插枝以45°插入含有iba的固体培养基的培养皿中，用封口膜封好后放在生化培养箱中（24℃，16小时光照）培养5-7天。拿出插枝，转移到不含iba的ms培养基中（同在iba培养基中一样，将插枝插入到培养基中）。在不含iba的培养基中培养2个星期后形成2-3cm的根。

实施例2：在含p5培养基的赛璐玢膜上培养双色蜡蘑真菌

在杨树与外生菌根真菌建立联系前10天，将外生菌根真菌双色蜡蘑接种至覆盖在p5培养基上的赛璐玢薄膜上培养直至长出菌丝。在p5培养基上接种双色蜡蘑（laccariabicolor），约12个接种点。p5培养基成分：其中每升含有麦芽糖5克，酒石酸铵0.5克，kh2po41.0克，mgso4·7h2o0.5克，葡萄糖1.0克，营养液1.0毫升（营养液含有铁离子6.0mg/ml,锌离子2.0mg/ml,铜离子0.6mg/ml，锰离子5.0mg/ml，硼酸8.0mg/ml），维生素b11.0毫升。培养皿用胶带密封，水平放置到真菌培养室。10天内培养皿被蜡蘑菌丝完全覆盖。如图1所示在干燥培养基上盖上一层赛璐玢膜，接种双色蜡蘑。待1星期后长出菌丝，备用。

实施例3：杨树根与蜡蘑菌丝建立联系

准备新鲜的p20培养基，其中每升培养基中含有酒石酸铵0.5克，kh2po41.0克，mgso4·7h2o0.5克，葡萄糖1.0克，营养液1.0毫升（营养液含有铁离子6.0mg/ml,锌离子2.0mg/ml,铜离子0.6mg/ml，锰离子5.0mg/ml，硼酸8.0mg/ml），维生素b11.0毫升。培养基中含有1g/lmes钠盐并在灭菌前调ph至5.8（蜡蘑分泌多种有机酸会酸化培养基，培养基加入mes缓冲液有利于稳定ph以避免植物产生胁迫反应）。p20培养基的准备方法如下：用0.25mol/l的koh溶液调ph至5.8，向溶液中加入20g/l的琼脂并灭菌。灭菌干燥后在p20培养基上覆盖赛璐玢膜。

将实施例1得到的生根的杨树插枝转移到p20培养基的赛璐玢膜上，从ms琼脂培养基中将它们取出时要小心以避免带有琼脂。

取实施例2制得的双色蜡蘑（laccaria）覆盖的赛璐玢膜，将带有双色蜡蘑（laccaria）的一面朝下放在植物根上（建立直接联系）或将其带有蜡蘑的一面朝上放在根上，如此植物不直接接触真菌（间接联系）。当建立直接联系，建议用锐刀片取下接种塞，因为其干扰一个有效，全面的直接接触，在间接联系中，接种塞没有影响。

在培养基顶部和底部用封口膜密封，侧面用更具渗透力的医用双面胶带（绷带）封住。用一个剪过的，小的黑色塑料袋盖住培养皿（根生长的地方）底部的一半并粘合（菌根生长在缺少光照的条件下）。将培养皿垂直放在培养室中（在植物生长室24℃，16小时光照）。1-2个星期后可观察到哈氏网的形成，说明了菌根共生体系的建立（图2）。如图3所示，对共生菌根进行冷冻切片，用wga-alexa488荧光染色真菌菌丝（灰色），发现菌丝用菌丝鞘包裹植物根（如21,35天图示），并且侵入根细胞之间；用碘化丙啶（propidiumiodide）荧光染色菌根组织发现了经过3-7天共培养建立了哈氏网。如图4所示，利用该系统培养的菌根组织rna质量经过bio-radexperion分析其rqi（rnaqualityindex）达到9.4，完全符合分子实验分析的高标准要求。