一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法与流程

本发明涉及海南三七，具体涉及一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，属于植物组织培养快速繁殖技术领域。

背景技术：

姜科(zingiberaceae)植物的繁殖方法可通过种子有性繁殖和切分根茎营养繁殖(高江云等，2006)。然而，有些种类是自交不亲和的，有些是多倍体，均不能结种子，只能通过根茎繁殖(高江云等，2006)。切分根茎分株时，不要分得太小，一般不要少于3‐4个，太少会导致生长缓慢或死亡，同时需要带有新生的块茎，新分开的块茎去掉所有茎、叶，以减少水分的丧失(高江云等，2006)。有的属的植物可以通过茎杆扦插来繁殖，如闭鞘姜属、舞花姜属、姜花属、姜属的部分种类，将成熟的茎杆切成带3‐4个节的茎段，直立插入沙土中2节，或茎段平放，用沙土稍微覆盖，保持湿润和遮荫，一段时间后，其节上的芽就会萌蘖形成小植株，稍大后分离栽培(高江云等，2006)。

海南三七(kaempferiarotunda)属于姜科山奈属(kaempferia)植物，分布于广东、广西、云南、台湾及亚洲南部至东南部(吴德邻等，1981)。其叶丛生，叶片长椭圆形，叶面淡绿色，具暗绿色斑纹，不耐霜冻，冬季地上部分枯死；花先于叶直接从根茎抽出，头状花序具4‐6朵花，花白色，唇瓣较大，紫红色；花期3‐4月；根茎药用有消肿止痛的功效；观叶类，株形好，叶漂亮，花晶莹美丽，在夏秋季节可作为观赏价值高的室内观叶植物(吴德邻等，1981；高江云等，2006；路国辉和王英强，2011；吴德邻等，2016)。由于海南三七不结果，所以不能进行有性繁殖。其也没有茎杆，因此，只能采用上述的切分根茎营养繁殖。因为母本量不足，切分根茎分株繁殖速度有限，而且对母株的损伤也很大，短期内得不到大量植株。

现有技术中，采用外植体诱导愈伤组织再分化成苗进行繁殖是可行的方法，但出苗率低，而且周期长。刘盼盼(华南师范大学硕士毕业论文，2013)将海南三七外植体分为假茎段(叶至块根之间的假茎)、叶片、根状茎、芽和茎尖(盆栽和组培苗)，结果盆栽的块茎、假茎段和叶片通过诱导愈伤组织再分化获得无菌苗的途径均失败；组培苗的假茎段和叶片诱导愈伤分化来获得无菌苗，由于愈伤组织增殖及诱导时间较久，并且愈伤至苗的诱导率不足10％，很难快速达到所需的无菌苗株数，故不采用此方法；组培苗的幼芽或茎尖，接种到ms+6‐ba3.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l的培养基中，20d左右有愈伤组织产生，30d左右有绒毛状根生成，但也发现，接种到两种培养基ms+6‐ba2.0/3.0mg/l+naa0.10mg/l上诱导，均只有10％诱导成苗，此种方法愈伤组织分化成苗率低。吴丹(华南师范大学硕士毕业论文，2014)将海南三七无菌苗的三个不同部位(叶片、假茎段和假茎段基部)接种在含有不同浓度的6‐ba和2，4‐d组合的愈伤诱导培养基上，置于黑暗条件下培养，40d后统计愈伤组织诱导情况，发现只有假茎段基部成功诱导出愈伤组织，最佳生长调节剂组合为6‐ba2.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l，再接种到愈伤组织分化第一阶段转绿需时30d，再将转绿的愈伤组织块转接入芽分化培养基中，40d左右可逐渐有苗长成，分化率大多集中在42％‐67％之间，此种方法愈伤分化出苗率仍然低，而且从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d，周期长。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，本发明采用根茎芽基部作为外植体，提供了一种海南三七根茎芽基部诱导再生植物的方法，建立了高效的海南三七植株再生体系，显著提高海南三七的组培繁殖效率。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)外植体前处理：采集海南三七的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的贮藏根和须根后，消毒后晾干；再放入洗净消毒的河沙中，恒温发芽，洗净根茎芽，取其芽基部为外植体材料；

(b)丛生芽诱导：将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养，直至外植体基部形成丛生芽；所述的诱导培养基成分为ms、6‐苄氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/l、萘乙酸0.01～0.10mg/l、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/l、卡拉胶粉9.5～10.0g/l；

(c)增殖继代：当初代芽基部丛生芽长至4～6cm时，切下芽，截取芽基部1.0‐1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽；所述增殖继代培养基成分为ms、6‐苄氨基腺嘌呤3.0～8.0mg/l、萘乙酸0.05～0.10mg/l、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/l、卡拉胶粉9.5～10.0g/l；

(d)生根培养：当继代苗高4～7cm时，切下接种到生根培养基中，所述生根培养基成分为ms、萘乙酸0.10～0.50mg/l、香蕉泥10.0～15.0％、活性炭1.0～1.5g/l、蔗糖20～30g/l、卡拉胶粉9.5～10.0g/l；

(e)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高5～8cm时，在温室自然光照下炼苗7～10d，取出瓶苗，洗净根部培养基，百菌清溶液消毒后，移栽到进口泥炭的基质中，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗。

为了进一步实现本发明目的，优选地，步骤(a)所述的根茎芽的芽高为6‐18cm，有1片叶。

优选地，步骤(a)所述的消毒后晾干的消毒是将海南三七的根茎放入质量浓度0.1‐0.3％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30‐40min。

优选地，步骤(a)所述的恒温发芽是在培养箱中33℃恒温发芽下进行。

优选地，步骤(a)所述的外植体为切掉海南三七根茎芽上的叶片和茎尖后留下的1～2cm的芽基部。

优选地，以质量百分比浓度计，步骤b)所述外植体的消毒是先用0.1％‐0.3％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30～40min，再用0.1％～0.3％的百菌清溶液，浸泡根茎芽30～40min，接着在自来水下反复冲洗根茎芽30～40min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1～0.2％升汞溶液消毒15‐18min，灭菌水冲洗4～5次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的芽基部，并将芽基部接种到诱导培养基中。

优选地，步骤(e)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

优选地，所述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的ph都为5.6～5.8；培养基灭菌条件为125℃，30～40min。

优选地，步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养的温度为25～30℃，光照强度为2000～2300lx，光照时间控制为14h/d。

优选地，步骤(e)所述百菌清溶液消毒是用0.1％～0.3％的百菌清溶液浸泡30～40min。

应用本发明的外植体消毒方法，消毒成活率可达到85～90％，15～20d能在外植体上观察到肉眼可见的绿点。

相对于现有技术，本发明的优点和有益效果为：

(1)本发明采用海南三七根茎芽基部为外植体，建立了高效的以芽繁芽途径的植株再生体系，外植体初代培养60～65d，启动率87.50％～98.50％，出芽指数2.15～4.60，外植体大部分可以分化出2‐5个丛生芽，长势较好；继代增殖经约20～25d培养，单个丛生芽基部可分化出4～9个丛生芽，可在100～108d内完成从外植体诱导丛生芽、继代增殖到生根苗形成的一个周期，单个丛生芽基部经过继代增殖，每个继代增殖周期可增殖4.69～7.56倍个丛生芽，即单个外植体在100～108d内可出芽10.08～34.77个。现有技术中，从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d，而且每块愈伤分化成苗2.38～3.75个。对比现有技术，本发明单个外植体在100～108d内可出芽10.08～34.77个，大大提高了海南三七的繁殖系数和减短了海南三七的繁殖周期。

(2)本发明只需简单的植物组织培养设备，就可在100～108d内完成从外植体诱导丛生芽、继代增殖到生根苗形成的一个周期，因此，可在短时间内获得大量的组培苗。本发明繁殖的海南三七种苗，能保持母株的优良特性，移栽成活率可达90％以上，具有投入低、产出高的优势。

附图说明

图1实施例1洗净的海南三七根茎图片。

图2实施例1在河沙中萌发洗净的根茎芽图片。

图3实施例1海南三七根茎芽基部外植体接种诱导培养基15d出现芽萌动图片。

图4实施例1外植体诱导出的丛生芽图片。

图5实施例1继代增殖的丛生芽图片。

图6实施例1生根培养形成的根系图片。

图7实施例1洗净根部培养基消毒后的组培苗图片。

图8实施例1移栽成活的组培苗图片。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，但实施例并不构成对本发明保护范围的限定。除非特别说明，本发明所采用的试剂和设备为本技术领域常规试剂和设备。

诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的ms，为国际通用的培养基，其成分和配制方法如下：

ms大量元素母液100倍：称100l量溶解在1l蒸馏水中，配1l培养基取母液10ml。母液的具体配法为：分别称硝酸铵165g，硝酸钾190g，二水氯化钙44g，七水硫酸镁37g，磷酸二氢钾17g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms微量元素母液1000倍：称1000l量溶解在1l蒸馏水中，配1l培养基取母液1ml。母液的具体配法为：分别称四水硫酸锰22.3g，七水硫酸锌8.6g，硼酸6.2g，碘化钾0.83g，二水钼酸钠2.5g，五水硫酸铜0.25g，六水氯化钴0.25g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms铁盐母液100倍：称100l量溶解在在1l蒸馏水中，配1l培养基取母液10ml。母液的具体配法为：分别称乙二胺四乙酸二钠3.73g，七水硫酸亚铁2.78g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms有机母液100倍：称100l量溶解在在1l蒸馏水中，配1l培养基取母液10ml。母液的具体配法为：分别称烟酸0.05g，盐酸吡哆素0.05g，盐酸硫胺素0.01g，肌醇10g，甘氨酸0.2g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1l。

实施例1

一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，包括如下步骤：

(a)外植体前处理：采集海南三七的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的贮藏根和须根后，放入质量浓度0.3％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30min，然后取出晾干表面水分，如图1所示。再放入洗净消毒的河沙中，培养箱中33℃恒温发芽，洗净芽，如图2所示，芽高6～18cm。消毒后，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留取芽基部为外植体材料。

(b)丛生芽诱导：将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养；如图3所示，外植体为根茎芽基部，高约1～2cm，在诱导培养基上培养15d就可观察到肉眼可见的绿点。外植体在诱导培养基上继续培养，直至外植体基部形成丛生芽；如图4所示，外植体在诱导培养基上培养60d就可形成3～5个丛生芽，外植体的启动率为98.50％，出芽指数为4.60[注：启动率＝(启动的外植体数/接种外植体总数)×100％；出芽指数：外植体上的出芽数的平均数]。所述的诱导培养基成分为ms、6‐苄氨基腺嘌呤3.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁15.0％、蔗糖30g/l、卡拉胶粉10.0g/l。

步骤(b)所述外植体的消毒是先用0.3％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30min，再用0.3％的百菌清溶液浸泡根茎芽30min，接着在自来水下反复冲洗根茎芽40min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒18min，灭菌水冲洗4次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留约1～2cm的芽基部，并将芽基部接种到诱导培养基中。

(c)增殖继代：当初代芽基部丛生芽长至4～6cm左右时，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽；如图5所示，为在继代增殖培养基上培养20d就可形成6‐9个丛生芽，增殖系数为7.56(增殖系数＝统计时的总芽数/接种时总芽数)。所述增殖继代培养基成分为ms、6‐苄氨基腺嘌呤8.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁15.0％、蔗糖30g/l、卡拉胶粉10.0g/l。

(d)生根培养：当继代苗高4～7cm时，切下接种到生根培养基中；如图6所示，为在生根培养基上培养20d就可形成白色的根。所述生根培养基成分为ms、萘乙酸0.10mg/l、香蕉泥15.0％、蔗糖30g/l、活性炭1.0g/l、卡拉胶粉10.0g/l。

(e)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高5～8cm时，在温室自然光照下炼苗10d，取出组培苗，洗净根部培养基，用0.3％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分，如图7所示，组培苗粗壮。移栽到进口泥炭的基质中，保持通风透气，湿度在70‐85％，温度在20‐32℃，自然光照条件培养后得到移栽苗；如图8所示，为在进口泥炭中种植25d后得到长势良好的移栽苗。

上述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的ph都为5.8；培养基灭菌条件为125℃，40min。

步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养温度为25～30℃，光照强度为2300lx，光照时间控制为14h/d。

步骤(e)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

实施例1从外植体诱导、继代增殖到生根苗约需时100d的时间。

实施例2

一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，包括以下步骤：

(a)外植体前处理：采集海南三七的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的贮藏根和须根后，放入质量浓度0.1％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒40min，然后取出晾干表面水分。再放入洗净消毒的河沙中，培养箱中33℃恒温发芽，洗净根茎芽。消毒后，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留取芽基部为外植体材料。

(b)丛生芽诱导：将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养，直至外植体基部形成丛生芽，需时约65d就可长出2～3个丛生芽，外植体的启动率为83.60％，出芽指数为2.15；所述的诱导培养基成分为ms、6‐苄氨基腺嘌呤1.0mg/l、萘乙酸0.01mg/l、椰汁10.0％、蔗糖20g/l、卡拉胶粉9.5g/l；

步骤(b)所述外植体的消毒是以质量百分比浓度计，先用0.1％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽40min，再用0.1％的百菌清溶液浸泡根茎芽40min，接着在自来水下反复冲洗根茎芽30min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.2％升汞溶液消毒15min，灭菌水冲洗5次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留约1～2cm的芽基部，并将芽基部接种到诱导培养基中。

(c)增殖继代：当初代芽基部丛生芽长至4～6cm左右时，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接种到增殖培养基中培养25d就可形成4～6个丛生芽，增殖系数为4.69；所述增殖继代培养基成分为ms、6‐苄氨基腺嘌呤3.0mg/l、萘乙酸0.05mg/l、椰汁10.0％、蔗糖20g/l、卡拉胶粉9.5g/l；

(d)生根培养：当继代苗高4～7cm时，切下接种到生根培养基中，需时约18d；所述生根培养基成分为ms、萘乙酸0.30mg/l、香蕉泥10.0％、活性炭1.5g/l、蔗糖20g/l、卡拉胶粉9.5g/l；

(e)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高5～8cm时，在温室自然光照下炼苗7d，取出试管苗，洗净根部培养基，用0.1％的百菌清溶液浸泡30min，移栽到进口泥炭的基质中，保持通风透气，湿度在70‐85％，温度在20‐32℃，自然光照条件培养后得到移栽苗。

上述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的ph都为5.6；培养基灭菌条件为125℃，30min。

步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养温度为25～30℃，光照强度为2000lx，光照时间控制为14h/d。

步骤(e)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

实施例2从外植体诱导、继代增殖到生根苗约需时108d的时间。

实施例3

一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，包括如下步骤：

(a)外植体前处理：采集海南三七的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的贮藏根和须根后，放入质量浓度0.2％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒35min，然后取出晾干表面水分。再放入洗净消毒的河沙中，培养箱中33℃恒温发芽，洗净芽。消毒后，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留取芽基部为外植体材料。

(b)丛生芽诱导：将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养，直至外植体基部形成丛生芽，需时约63d，可形成3～4个丛生芽，外植体的启动率为95.70％，出芽指数为3.50；所述的诱导培养基成分为ms、6‐苄氨基腺嘌呤2.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁10.0％、蔗糖30g/l、卡拉胶粉10.0g/l；

步骤(b)所述外植体的消毒是先用0.2％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30min，再用0.2％的百菌清溶液浸泡根茎芽30min，接着在自来水下反复冲洗根茎芽40min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒18min，灭菌水冲洗4次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留约1～2cm的芽基部，并将芽基部接种到诱导培养基中。

(c)增殖继代：当初代芽基部丛生芽长至4～6cm左右时，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接种到增殖培养基中培养22d就能诱导5～7个丛生芽，增殖系数为5.87；所述增殖继代培养基成分为ms、6‐苄氨基腺嘌呤5.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁10.0％、蔗糖30g/l、卡拉胶粉10.0g/l；

(d)生根培养：当继代苗高4～7cm时，切下接种到生根培养基中，需时约17d，所述生根培养基成分为ms、萘乙酸0.50mg/l、香蕉泥10.0％、蔗糖30g/l、活性炭1.0g/l、卡拉胶粉10.0g/l；

(e)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高5～8cm时，在温室自然光照下炼苗10d，取出组培苗，洗净根部培养基，用0.2％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分，移栽到进口泥炭的基质中，保持通风透气，湿度在70‐85％，温度在20‐32℃，自然光照条件培养后得到移栽苗。

上述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的ph都为5.8；培养基灭菌条件为125℃，40min。

步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养温度为25～30℃，光照强度为2300lx，光照时间控制为14h/d。

步骤(e)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

实施例3从外植体诱导、继代增殖到生根苗约需时102d的时间。

本发明采用海南三七的根茎芽基部为外植体，建立了高效的以芽繁芽途径的植株再生体系，外植体初代培养60～65d，启动率87.50％～98.50％，出芽指数2.15～4.60，外植体大部分可以分化出2‐5个丛生芽，长势较好；继代增殖经约20～25d培养，单个丛生芽基部可分化出4～9个丛生芽，可在100～108d内完成从外植体诱导丛生芽、继代增殖到生根苗形成的一个周期，单个丛生芽基部经过继代增殖，每个继代增殖周期可增殖4.69～7.56倍个丛生芽，即单个外植体在100～108d内可出芽10.08～34.77个。

现有技术中，刘盼盼(华南师范大学硕士毕业论文，2013)将海南三七外植体分为假茎段(叶至块根之间的假茎)、叶片、根状茎、芽和茎尖(盆栽和组培苗)，结果盆栽的块茎、假茎段和叶片通过诱导愈伤组织再分化获得无菌苗的途径均失败；组培苗的假茎段和叶片诱导愈伤分化来获得无菌苗，由于愈伤组织增殖及诱导时间较久，并且愈伤至苗的诱导率不足10％，很难快速达到所需的无菌苗株数；组培苗的幼芽或茎尖，接种到ms+6‐ba3.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l的培养基中，20d左右有愈伤组织产生，30d左右有绒毛状根生成，但也发现，接种到两种培养基ms+6‐ba2.0/3.0mg/l+naa0.10mg/l上诱导，均只有10％诱导成苗，此种方法愈伤组织分化成苗率低。

吴丹(华南师范大学硕士毕业论文，2014)将海南三七无菌苗的假茎段基部接种在ms+6‐ba2.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l培养基上，置于黑暗下培养，40d后诱导出愈伤组织，再接种到愈伤组织分化第一阶段转绿需时30d，此时每块愈伤平均可得到5.69个芽点，再将转绿的愈伤组织块转接入芽分化培养基中，40d左右可逐渐有苗长成，分化率在42％～67％，即仅仅从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d，每块愈伤分化成苗2.38～3.75个。

现有技术从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d，而且每块愈伤分化成苗2.38～3.75个；本发明单个外植体在100～108d内可出芽10.08～34.77个，大大提高了海南三七的繁殖系数和减短了海南三七的繁殖周期，可在短时间内获得大量的组培苗。本发明繁殖的海南三七种苗，能保持母株的优良特性，移栽成活率可达90％以上，具有投入低、产出高的优势。