本发明涉及万宁柯无性繁殖技术，尤其是一种万宁柯初代培养芽诱导方法。
背景技术：
万宁柯（Lithocarpus elmerrillii），系壳斗科（Fagaceae）柯属（Lithocarpus）乔木，高达25米，当年枝有纵沟棱，无毛，干后暗褐色，2或3年生枝散生灰白色皮孔，芽鳞半圆形或阔三角形，干后油润有光泽。叶薄革质，长椭圆形或少有倒卵状椭圆形，长10-17厘米，宽3-6厘米，顶部渐尖，基部渐狭长尖，沿叶柄下延将至基部，全缘，侧脉每边9-12条，在近叶缘处急弯向上而隐没，支脉纤细，叶背有紧实的蜡鳞层，干后带灰白色；叶柄长2-2.5厘米。雌花单朵散生于花序轴上；果序轴粗6-7毫米，壳斗聚生于果序轴的上部，浅碗状，高6-10毫米，宽17-25毫米，顶部边缘甚薄，渐向下部明显增厚，木质，基部狭窄，呈甚短的柄状，包着坚果基部，小苞片三角形，紧贴壳壁，上部的覆瓦状排列，甚小，下部的通常连生成环状；坚果近圆球形而顶端尖，或为扁圆形，高20-25毫米，高25-30毫米，无毛，栗褐色，透熟时有纵裂纹，果脐位于底部，深约2毫米，径14-16毫米，果壁上部厚达2.5毫米。果期9-10月。产海南中南部（吊罗山）。生于海拔500-750米常绿阔叶林中。
目前，万宁柯资源仍处于野生分布状态，但随着保护植物多样性的需求，规模化人工栽培万宁柯资源势在必行。组织培养技术是一种快速无性繁殖技术，选择万宁柯优良家系或者无性系为材料，通过组织培养方法繁殖苗木，既可以满足生产上的数量要求，又可保持母本性状。组织培养过程中，初代培养是制约组织培养顺利进行的关键步骤，其中涉及了外植体的获取、外植体的消毒、培养基选择以及培养过程中培养体褐变、苗木玻璃化等重要问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能克服芽诱导过程中外植体褐变以及玻璃化等问题，提高芽诱导率，出芽指数以及萌芽生长状况，获取数量多、质量好的萌芽，从而满足增殖培养的需要，促进万宁柯组织培养快速繁殖体系的建立的万宁柯初代培养芽诱导方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种万宁柯初代培养芽诱导方法，采用万宁柯基部萌条为外植体，通过外植体无菌处理后，将外植体接种于优质初代培养芽诱导培养基上，置于适宜的温度、湿度和光照强度条件下进行培养，诱导芽的萌发；其操作步骤为，
（1）外植体选择：选择万宁柯基部萌发的半木质化的萌条为外植体；
（2）外植体消毒及接种：将万宁柯萌条经过洗洁精清洗，流水冲洗和化学试剂处理消毒后，剪切成茎段接入芽诱导培养基中；
（3）芽诱导培养：将接种后的外植体置于适宜室内条件下培养。
以上所述的芽诱导培养基其原料含量为：1/3～1/2改良WPM培养基+6-KT 1.0～2.0mg/L+维生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。
以上所述的改良WPM培养基组分和体积重量比为：NH4NO3 850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇85 mg/L，烟酸1.0 mg/L，盐酸吡哆醇1.0 mg/L，盐酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
以上所述的萌条是长为6~9cm、直径0.2～0.4 cm的半木质化的萌条。
以上步骤（2）所述的消毒及接种方法是将万宁柯萌条针叶剪去，置于三角瓶中，加入体积浓度为1~5 %的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于转速为200 r/min的摇床上清洗10~15 min后置于流水下冲洗1~2 h，然后用无菌水清洗2次，将外植体转到超净工作台上用体积浓度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用无菌水冲洗8~10次后剪成长为3.5~4.0 cm长的茎段接种于芽诱导培养基中，每瓶接种2个茎段。
以上步骤（3）所述的适宜室内条件为：暗培养10d后转为光照500～1000 lx，光照8～12h/d；培养温度20±1℃，湿度为50~55 %。
本发明具有的优点及有益效果如下：
1、本发明采用1/3～1/2改良WPM培养基培养基作为基本培养基，同时重点调整了与万宁柯出芽相关的微量元素和有机成分，使得培养基更科学，更有针对性，有效的克服了万宁柯组织培养芽诱导过程中易出现的玻璃化现象，更易促使万宁柯芽诱导的发生，促进了萌芽的生长速度和健壮度。
2、本发明以基部长6~9 cm长的半木质化粗壮萌条作为外植体，保证了外植体较强的分生能力，促进芽的诱导；本发明在外植体采集后进行洗净、消毒，有效降低外植体的污染率，提高了出芽率。
3、本发明将接种后的外植体置于温度为度20±1℃，湿度为50~55%，光照由暗培养后转到强度为500～1000 lx的室内条件下培养，温度和湿度偏低，光照强度也不高的室内条件，有利于减少芽诱导过程中玻璃化的发生。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
选择万宁柯基部萌发、长为6~7cm、直径0.2～0.3 cm的半木质化的萌条作为外植体。将万宁柯萌条针叶剪去，置于三角瓶中，加入体积浓度为1 %的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于转速为200 r/min的摇床上清洗10 min后置于流水下冲洗2 h，然后用无菌水清洗2次，将外植体转到超净工作台上用体积浓度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用无菌水冲洗8~10次后剪成长为3.5 cm长的茎段接种于芽诱导培养基中，每瓶接种2个茎段。
所述的芽诱导培养基其原料含量为：1/3改良WPM培养基+6-KT 1.0mg/L+维生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培养基组分和体积重量比为：NH4NO3 850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，烟酸1.0 mg/L，盐酸吡哆醇1.0 mg/L，盐酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
将接种后的外植体置于温度20±1℃，湿度为50 %室内暗培养10d后转为光照500 lx，光照12h/d的条件下进行培养，诱导芽的萌发。
实施例2：
选择万宁柯基部萌发、长为7~8cm、直径0.2～0.3 cm的半木质化的萌条作为外植体。将万宁柯萌条针叶剪去，置于三角瓶中，加入体积浓度为2%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于转速为200 r/min的摇床上清洗10 min后置于流水下冲洗1.5 h，然后用无菌水清洗2次，将外植体转到超净工作台上用体积浓度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用无菌水冲洗8~10次后剪成长为3.5 cm长的茎段接种于芽诱导培养基中，每瓶接种2个茎段。
所述的芽诱导培养基其原料含量为：1/3改良WPM培养基+6-KT 1.5mg/L+维生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培养基组分和体积重量比为：NH4NO3 850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，烟酸1.0 mg/L，盐酸吡哆醇1.0 mg/L，盐酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
将接种后的外植体置于温度20±1℃，湿度为50 %室内暗培养10d后转为光照500lx，光照10h/d的条件下进行培养，诱导芽的萌发。
实施例3：
选择万宁柯基部萌发、长为7~8cm、直径0.3～0.4 cm的半木质化的萌条作为外植体。将万宁柯萌条针叶剪去，置于三角瓶中，加入体积浓度为4%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于转速为200 r/min的摇床上清洗15 min后置于流水下冲洗1 h，然后用无菌水清洗2次，将外植体转到超净工作台上用体积浓度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用无菌水冲洗8~10次后剪成长为4.0 cm长的茎段接种于芽诱导培养基中，每瓶接种2个茎段。
所述的芽诱导培养基其原料含量为：1/2改良WPM培养基+6-KT 1.5mg/L+维生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培养基组分和体积重量比为：NH4NO3 850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，烟酸1.0 mg/L，盐酸吡哆醇1.0 mg/L，盐酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
将接种后的外植体置于温度20±1℃，湿度为55 %室内暗培养10d后转为光照1000 lx，光照10h/d的条件下进行培养，诱导芽的萌发。
实施例4：
选择万宁柯基部萌发、长为8~9cm、直径0.3～0.4 cm的半木质化的萌条作为外植体。将万宁柯萌条针叶剪去，置于三角瓶中，加入体积浓度为5 %的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于转速为200 r/min的摇床上清洗15 min后置于流水下冲洗1h，然后用无菌水清洗2次，将外植体转到超净工作台上用体积浓度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用无菌水冲洗8~10次后剪成长为4.0 cm长的茎段接种于芽诱导培养基中，每瓶接种2个茎段。
所述的芽诱导培养基其原料含量为：1/2改良WPM培养基+6-KT 2.0mg/L+维生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培养基组分和体积重量比为：NH4NO3 850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，烟酸1.0 mg/L，盐酸吡哆醇1.0 mg/L，盐酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
将接种后的外植体置于温度20±1℃，湿度为55 %室内暗培养10d后转为光照1000 lx，光照8h/d的条件下进行培养，诱导芽的萌发。