一种海水鱼类的精巢冷冻保存剂及精原细胞的制备方法与流程

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种海水鱼类的精巢冷冻保存剂及精原细胞的制备方法。

背景技术：

鱼类生殖细胞移植，即通过显微注射的方法，将供体鱼的生殖细胞注射到宿主鱼的腹腔中，移植后的细胞通过伪足迁移至生殖腺中进行发育，进而形成生殖细胞，最终生成供体来源的成熟配子，这项技术也被称为鱼类的“借腹生子”技术，为优良珍稀物种的种质资源保存创建了新途径。经过实验探索发现，a型精原细胞是进行移植的有效生殖细胞，可以从鱼类精巢中提取制备。如果能够将鱼类精巢长期冻存，并将解冻后精巢制备生殖细胞移植到受体，将大大拓宽鱼类生殖细胞移植技术的应用范围和途径。因此，解决精巢长期保存并制备可供移植的生殖细胞是该技术的关键步骤之一。

超低温冷冻保存是种质资源长期保存的重要方法之一。超低温保存的样品可进行长距离的运输，同时可以根据需要进行解冻，提高其利用率，是进行精巢长期保存的可行途径之一。1953年，blaxter尝试冷冻保存大西洋鲱鱼(clupeaharengus)精巢以达到保存精子的目的，在其后的60多年里，世界许多国家的科研工作者围绕超低温保存的降温方法、抗冻液的筛选、冷冻、解冻速率等方面开展了大量的研究工作，建立了成熟的超低温冷冻保存方法。但是，这些研究主要以保存精子、胚胎、组织等为目的，对于是否能够有效保存精原细胞并未涉及。考虑到不同的细胞或组织的特异性以及鱼种的特异性，建立海水鱼类的精原细胞冷冻保存方法非常必要。

技术实现要素：

本发明提供了一种海水鱼类的精巢冷冻保存剂及精原细胞的制备方法。本发明提供了适合石首鱼类精巢冷冻保存的抗冻剂配方，建立了石首鱼类精巢冷冻保存和精原细胞制备方法，为生殖细胞移植技术提供技术保障。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种海水鱼类的精巢冷冻保存剂，所述冷冻保存剂包括：体积比为4-8:1-2:1-2:1-2的l-15培养液：卵黄：海藻糖：二甲基亚砜，所述海藻糖的摩尔浓度为1m。

进一步的：所述冷冻保存剂包括：体积比为7:1:1:1的l15培养液：鸡蛋卵黄：海藻糖：二甲基亚砜。

本发明还提供了利用所述的精巢冷冻保存剂的精原细胞的制备方法，它包括以下步骤：

（1）解剖取出雄性鱼类的精巢；

（2）取l-15培养液加入到新鲜精巢中，剪碎；将剪碎后的精巢进行离心，弃上清液，再加入l-15培养液反复清洗；

（3）将冷冻管预冷，向其中加入所述冷冻保存剂；将剪碎的精巢移入到加有冷冻保存剂的冷冻管中；冰上冷处理；

（4）再将冷冻管冷处理并保存在液氮中；

（5）将装有精巢的冷冻管从液氮中取出，对冷冻的精巢进行融化处理；

（6）用l-15培养液清洗融化后的精巢，离心，加入蛋白酶消化液进行消化；

（7）将消化后的组织液过滤，加入dnaseⅰ进行消化，离心弃上清；

（8）然后再加入l-15培养液，使细胞终浓度为5-20×10⁶个细胞，加入染色剂染色；

（9）加入1mll-15培养液终止反应，离心后弃上清，加入l-15培养液清洗，加入l-15培养液、胎牛血清和dnaseⅰ重新悬浮细胞，置于冰上备用。

进一步的：所述步骤（1）中雄性鱼类为石首鱼类。

进一步的：所述步骤（1）中所述石首鱼类为黄姑鱼和鮸鱼。

进一步的：所述步骤（5）中所述冷冻精巢的融化处理的步骤为：将装有精巢的冻存管从液氮中取出，10℃水浴2～3min；然后将精巢移到冰上。

进一步的：所述步骤（6）中消化的步骤为：将融化后的精巢组织离心，采用l-15培养液清洗后，采用2～4倍体积的蛋白酶消化液置于室温下消化3～5h。

进一步的：所述蛋白酶消化液为：将质量比为0.25%的胰蛋白酶、4mg/ml的胶原蛋白酶h、质量比为5%的胎牛血清和质量比为0.05%的dnaseⅰ溶于l-15培养液制得。

进一步的：所述步骤（7）中消化的步骤为：用30～50µl0.05%的dnaseⅰ置于4℃消化10min。

进一步的：所述步骤（9）中加入5%胎牛血清和0.5%dnaseⅰ于细胞悬浮液中。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：在超低温冷冻保存过程中，适宜的冷冻保存剂、冷冻保存剂的组分配比是种质细胞保存成功的关键因素。本发明提供的海水鱼类精巢的冷冻保存方法可以保证精巢的长期冷冻保存；所建立的精原细胞的制备方法，操作简便易行；本发明扩大了生殖细胞移植的供体来源；将精巢长期冷冻保存，可以做到按需使用，为生殖细胞移植的供体来源提供保障，大大拓宽鱼类生殖细胞移植的应用范围。

附图说明

图1为经过本发明保存方法保存后再取出的精巣细胞图，其中图a为显微镜下观察的精巢细胞，图b为经pkh26染色后的精巢细胞。箭头所示为a型精原细胞，是具有在受体中增殖能力的生殖细胞。

图2为将精原细胞移植到黄姑鱼体内三周后鮸鱼生殖细胞的嵌合图，其中图a为明视野观察的性腺，图b为荧光视野观察的性腺，性腺中嵌入荧光染色的生殖细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

利用本发明所述的冷冻保存剂的精原细胞制备方法具体包括以下步骤：

1.配制100ml冷冻保存剂：70mll-15培养液，10ml鸡蛋卵黄，10ml1m海藻糖，10ml二甲基亚砜（dmso）。

2.将10条3月龄（全长14.34±0.63cm；体重34.38±3.98g）雄性黄姑鱼采用ms222麻醉后，解剖取出精巢。

3.取适量的l-15培养液于胚胎皿中，将新鲜精巢放入，用剪刀剪碎（标准大小3mm×3mm即可）；将剪碎后的精巢移入离心管中，300rpm离心，弃上清液，再加入l-15反复清洗3-5次。

4.将2.5ml冷冻管置于冰上预冷，向其中加入2ml所述冷冻保存剂。将剪碎的精巢移入到加有冷冻培养液的冷冻管中，每2ml冷冻培养液中，加入5～6块3mm×3mm的剪碎后的精巢。冰上冷处理60min。

5.将冷冻管移入预冷过的bicell盒中，置于-80°冷处理90min。将冷冻管保存在液氮中。

6.将装有精巢的冷冻管从液氮中取出，10℃水浴2～3min，将精巢移到冰上即可，用于制备精原细胞。

7.采用6mll-15培养基清洗组织块，4℃200g离心5min，重复清洗3次后，加入4ml蛋白酶消化液（0.25%胰蛋白酶、4mg/ml胶原蛋白酶h、5%胎牛血清、0.05%dnaseⅰ溶于l-15培养基）到6孔板中，置于25℃消化3h。

8.将消化后的组织液采用50µm滤器过滤，过滤后的消化液中加入50µl0.05%dnaseⅰ处理10min，然后对消化液在4℃200g离心5min弃上清。

9.离心后加入1mll-15悬浮细胞，采用血球计数板进行计数，计数后的终细胞浓度为10×10⁶个细胞，加入16µlpkh26和1548µldiluentc，室温下染色5min。pkh26的终浓度为10µm。

10.加入1mll-15培养基组终止反应，4℃200g离心5min后弃上清，加入2mll-15培养基清洗2次，加入800µll-15培养液、100µl5%胎牛血清和0.5%dnaseⅰ重新悬浮细胞，置于冰上用于显微注射。

实施例2

1.配制50ml冷冻保存剂：35mll-15培养液，5ml鸡蛋卵黄，5ml1m海藻糖，5ml二甲基亚砜（dmso）。

2.将1条1龄（全长38.2cm；体重350.9g）雄性鮸鱼采用ms222麻醉后，解剖取出精巢。

3.取适量的l-15培养液于胚胎皿中，将新鲜精巢放入，用剪刀剪碎（标准大小3mm×3mm即可）；将剪碎后的精巢移入离心管中，300rpm离心，弃上清液，再加入l-15反复清洗3-5次。

4.将2.5ml冷冻管置于冰上预冷，向其中加入2ml所述冷冻保存剂。将剪碎的精巢移入到加有冷冻培养液的冷冻管中，每2ml冷冻培养液中，加入5-6块3mm×3mm的剪碎后的精巢。冰上冷处理60min。

5.将冷冻管移入预冷过的bicell盒中，置于-80°冷处理90min。将冷冻管保存在液氮中。

6.将装有精巢的冷冻管从液氮中取出，10℃水浴2-3min，将精巢移到冰上即可，用于制备精原细胞。

7.采用6mll-15培养基清洗组织块，4℃200g离心5min，重复清洗3次后，加入4ml蛋白酶消化液（0.25%胰蛋白酶、4mg/ml胶原蛋白酶h、5%胎牛血清、0.05%dnaseⅰ溶于l-15培养基）到6孔板中，置于25℃消化3h。

8.将消化后的组织液采用50µm滤器过滤，过滤后的消化液中加入50µl0.05%dnaseⅰ处理10min，然后对消化液在4℃200g离心5min弃上清。

9.离心后加入1mll-15悬浮细胞，采用血球计数板进行计数，计数后的终细胞浓度为5×10⁶个细胞，加入8µlpkh26和774µldiluentc，室温下染色5min。pkh26的终浓度为10µm。

10.加入1mll-15培养基组终止应，4℃200g离心5min后弃上清，加入2mll-15培养基清洗2次，加入500µll-15培养液、100µl5%fbs和0.5%dnaseⅰ重新悬浮细胞，置于冰上用于显微注射。

取出经过本发明保存方法保存后的精巢制备精原细胞，通过显微镜观察，如图1所示，可以看到经冷冻保存后的精原细胞仍为存活，细胞活力尚佳，精原细胞成活率在60%以上。将生殖细胞移植到12日龄黄姑鱼体内，3周后解剖取性腺，在显微镜下观察发现，鮸鱼生殖细胞成功嵌合到黄姑鱼性腺内（如图2），证明采用冷冻精巢提取的生殖细胞，能够进行细胞移植。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。