一种金花葵植株高效繁育的方法与流程

本发明涉及一种金花葵的繁殖方法，尤其涉及的是一种金花葵植株高效繁育的方法。

背景技术：

金花葵(学名：hibiseumanihotl.)，又名：菜芙蓉，也称：野芙蓉，为一年生草本锦葵科秋葵属植物。2003年8月被中国农科院在河北邢台地区发现濒临绝种的植物，在200多个秋葵属植物中，金花葵既有观赏价值，又具有食用、药用和保健功能，而且适应性极强，耐寒、耐热、耐盐碱，可在40℃高温和-10℃低温地区种植，具有极高的开发潜力和利用价值。

金花葵既可庭院种植，也可园林、大田产业化栽培，还可以做成盆景，或以香味植物出售，典雅高贵，具有很高的观赏价值。金花葵的花药食兼用，含有多种生物活性物质，其中黄酮含量极高(高达6％)，是目前已知植物资源中含量最高的；其所含的全价蛋白、高聚糖胶，膳食纤维、微量元素硒、锌、多种不皂化物等，具有显著调节人体免疫力，改善心脑血管及微循环功能，增强机体抗氧化能力，抗心脑缺血、缺氧、抗炎、镇疼，抗疲劳、抗衰老、抗癌、防癌、降血脂功效。此外，金花葵的嫩果可食，富含人体所需的多种氨基酸和微量元素，所含的雄性激素较高，是被称为植物伟哥补肾草物(即黄、红秋葵)的1.6倍，常食对提高男性中老年的性功能具有显著效果。总之，金花葵的全身是宝，但因资源极少很难进行深加工开发，因此具有极高的社会经济价值。

目前，在生产上，金花葵主要采用播种繁殖，繁育过程繁琐且受播种季节限制。植物组织培养技术因其具有繁育周期短，繁殖系数高，所需要的外植体材料少等优势，在植物的规模化繁育中起着重要作用。利用植物组织培养技术可在短期内获得大量的金花葵幼苗，在实现金花葵优良种质资源规模化繁育的同时，使得加速金花葵的品种改良进程成为可能。目前，有关利用植物组织培养技术对金花葵进行繁育的研究尚未有报道。为了满足金花葵优质种苗规模化种植及品种改良的需求，急需开发一种金花葵植株高效繁育的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种金花葵植株高效繁育的方法，能够实现金花葵的高效、稳定和规模化的繁育。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

(1)取成熟饱满的金花葵种子作为初始材料，进行表面消毒；

(2)将消毒后的种子接种到萌发培养基中，经1～2周的光照培养，获得高度为2.0～5.0cm的无菌苗；

(3)无菌条件下，将金花葵无菌苗的茎段切段，接种于不定芽诱导培养基中，经过2～3周的光照培养后，茎段两端切口处诱导出不定芽丛；

(4)将带有不定芽丛的茎段转接于伸长培养基中进行不定芽的伸长培养；

(5)待不定芽长至2～3cm并伴有2～4片完整叶片时，转至生根培养基中进行生根培养，光照培养2～3周后，获得根系健壮的金花葵试管苗。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，所述表面消毒是将种子用流水冲洗5～15min后，在无菌操作台中用75％无水乙醇消毒45～90s，之后用20～30％的次氯酸钠溶液消毒3～7min，再用600w的超声仪超声处理3～5min，最后用无菌水冲洗5～6遍。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，萌发培养基为添加有0.05～0.5mg/l6-ba、0.02～0.2mg/lga3、15～30g/l蔗糖和6.0～8.0g/l琼脂的ms培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，所述适宜大小的切段是指将无菌苗茎段切成长度为0.3～1.0cm大小的切段。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，不定芽诱导培养基为添加有0.2～3.0mg/ltdz、0.05～0.5mg/lkt、20～35g/l蔗糖和6.5～8.0g/l琼脂的ms培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，伸长培养基为添加有0.2～1.0mg/lkt、0.05～0.2mg/lga3、20～35g/l蔗糖和6.5～8.0g/l琼脂的1/2ms培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，生根培养基为添加有0.1～1.0mg/liba、5.0～20.0mg/l亚精胺、15～25g/l蔗糖和6.5～8.0g/l琼脂的1/4ms培养基。

作为本发明的优选方式之一，在金花葵茎段再生的过程中，培养条件为23土2℃、光照培养，光照强度2500～3000lx，光照时间为14～16h。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明的金花葵播种育苗过程繁琐，费时费力且受季节限制，不能满足金花葵产业化的需求，目前有关金花葵植株离体再生的而研究尚未有报道，本发明将为金花葵种苗的快速繁殖和分子遗传改良提供重要的技术支持，以打破有关该研究目前尚属空白的局面；本发明取材方便、材料丰富；再生效率高，茎段再生率高达97.8％，平均每个外植体可产生4.4个不定芽，无菌苗的生根率高达100％；进行金花葵种苗的繁育可以不必通过种子育苗，从而解除了金花葵育苗的时间限制，提高了种苗繁育系数，为后期金花葵优良株系的规模化繁育及品种改良研究奠定了基础.再生速度快，繁殖系数高，且能实现对所获得的金花葵无菌苗茎段进行进一步的扩大繁殖，同时，这种高效的再生方法为金花葵的遗传育种提供了技术支撑。

附图说明

图1是实施例1中金花葵种子实生苗图；

图2是实施例1中接种于不定芽诱导培养中的金花葵茎段图；

图3是实施例1中不定芽诱导图；

图4是实施例1中不定芽伸长图；

图5是实施例1中不定芽生根图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的金花葵植株高效繁育的方法，包括以下步骤：

(1)取成熟饱满的金花葵种子，经流水冲洗10min后，于无菌操作台中用75％无水乙醇消毒60s，再用25％的次氯酸钠溶液消毒5min，再用600w的超声仪超声处理4min，最后用无菌水冲洗6遍，滤纸吸干种子表面水分，备用。

(2)将步骤(1)中消毒后的金花葵种子接种于种子萌发培养基中，于温度为24℃、光照强度2500lx，光周期为16/10h(光/暗)的恒温培养室进行萌发诱导，经过2周的光照培养，获得高度为2.0～5.0cm，带有2～3个真叶的完整种子实生苗植株，如图1所示。其中种子萌发培养基为添加有0.2mg/l6-ba、0.1mg/lga3、30g/l蔗糖和6.5g/l琼脂的ms培养基。

(3)将步骤(2)中获得的金花葵无菌苗的茎段切成0.5cm大小的切段，接种于不定芽诱导培养基于恒温培养室进行不定芽的诱导，如图2所示。光照培养3周后获得嫩绿不定芽丛，不定芽的诱导率高达97.8％，且平均每个外植体产生4.4个不定芽，如图3所示。其中金花葵茎段不定芽诱导培养基为添加有2.0mg/ltdz、0.2mg/lkt、25g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的ms培养基。

(4)将步骤(3)中获得的金花葵不定芽丛转接于不定芽伸长培养基中进行进一步的伸长培养，光照培养2周后获得长为2～4cm，带有2～3片的金花葵小苗，如图4所示。其中金花葵茎段不定芽伸长培养基为添加有0.3mg/lkt、0.15mg/lga3、25g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的1/2ms培养基。

(5)将步骤(4)中伸长后的不定芽转接于金花葵生根培养基中，光照培养3周后获得根系发达的金花葵再生植株，如图5所示，生根率高达100％且平均每个外植体产生7～8条长度为3～4cm的不定根。其中生根培养基为添加有0.2mg/liba、15.0mg/l亚精胺、20g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的1/4ms培养基。

实施例2

本实施例测试了不同浓度6-ba和ga3对上述实施例实施过程中的金花葵种子萌发效果的影响，具体操作如下：

将消毒后的金花葵种子，接种于添加有不同浓度6-ba(0，0.05，0.1，0.2，0.5mg/l)和ga3(0，0.02，0.1，0.2mg/l)的ms培养基中，于温度为24℃，光照强度为2500lx，光照时间为16h的恒温培养室进行种子萌发诱导。培养2周后统计种子萌发率和长势。结果如表1所示。

表1不同浓度6-ba和ga3对金花葵种子萌发的影响

表1结果表明，培养基中单独添加6-ba时，随着6-ba浓度的增加，种子的萌发率出现先逐渐增加后降低的现象，且在6-ba浓度为0.5mg/l时，金花葵种子在萌发的过程中存在畸形现象；培养基中单独添加ga3时，随着ga3浓度的增加，金花葵种子的萌发率逐渐增加，在ga3浓度为0.2mg/l时，金花葵种子的萌发率最高达到88.3％。进一步研究发现，低浓度的6-ba和ga3结合使用对金花葵种子萌发具有明显的促进作用；当培养基中添加0.2mg/l6-ba和0.1mg/lga3时，种子的萌发率为100％，且幼苗长势健壮。

实施例3

本实施例测试了不同浓度iba和亚精胺对金花葵不定芽生根效果的影响，具体操作如下：

将伸长后的不定芽转接于添加有不同浓度iba(0.1，0.2,0.5,1.0mg/l)和亚精胺(5.0,10.0,15.0,20.0mg/l)的1/4ms培养基中，光照培养3周后，统计生根率、平均每个外植体所产生的生根数和平均根长。结果如表2所示。

表2不同浓度iba和亚精胺对金花葵不定芽生根效果的影响

表2结果表明，培养基中单独添加iba时，随着iba浓度的增加，种子的萌发率出现先逐渐增加后降低的现象，iba浓度为0.2mg/l时，金花葵不定芽生根效果最佳，生根率为87.5％。进一步研究发现，0.2mg/liba和亚精胺结合使用对金花葵不定芽生根具有明显的促进作用；当培养基中添加0.2mg/liba和15mg/l亚精胺时，不定芽生根率高达100％，平均每个外植体长有7.3个不定根，平均根长3.9cm，且幼苗长势健壮。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。