本发明属于玉米育种技术领域，具体涉及一种利用ems诱变产生玉米突变体的方法。
背景技术：
玉米是世界上仅次于小麦和水稻的农作物，通过杂交手段培育的新品种的发展空间小，品种的抗逆性不全面。利用诱变技术培育玉米新品种，其变异范围广，可产生自然突变难以出现的新基因突变体。目前常用的有变方法有化学诱变、电力辐射诱变、生物诱变以及空间诱变等方法。甲基磺酸乙酯是玉米常用的且使用最广的诱变剂。利用ems(甲基磺酸乙酯)处理玉米花粉的诱变技术，不仅可以创造新型使用的具有经济价值的突变体种质资源，而且为玉米生长发育等基础性研究提供较高学术价值的玉米突变体。
由于玉米不同自交系对ems的敏感程度不同，而且玉米自交系中的特定基因不尽相同，甚至一些重要的基因在某些玉米自交系中根本不存在，这就给重要突变体的筛选造成了障碍。目前通用的ems诱变方法为玉米花粉诱变，使用的ems的体积浓度为0.667-9.99‰。中国专利cn102835300a公开了一种ems诱变w64a花粉高效获得分蘖突变体的方法，该方法测试了不同ems诱变溶液浓度以及不同玉米自交系对获得玉米分蘖突变体比率的影响，得到了适用于w64a花粉的高效诱变溶液浓度。但是该专利仅仅实在已公开的ems诱变溶液浓度范围内进行了选择，仅仅包括ems诱变剂一种诱变方式，但是由于不同诱变剂对玉米花粉的制变作用机理不同，单一的诱变方式仅在某一方面具有高效的突变频率，该方法与其他玉米自交系b73、mo17等中的突变频率仍较低，单一的ems诱变方式在不同玉米自交系中通用性较差。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供的一种利用ems诱变产生玉米突变体的方法，解决了现有技术中单一的ems诱变方式在不同玉米自交系中通用性较差的问题。
本发明的目的是提供一种利用ems诱变产生玉米突变体的方法，包括以下步骤：
s1，花粉收集
给处于散粉早期玉米的雄穗套袋，收集玉米花粉；
选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋，得到待授粉玉米植株；
s2，花粉诱变处理
配制ems-石蜡油溶液，将s1收集的花粉除掉花药后，加入到ems-石蜡油溶液中，按以下步骤进行诱变：(1)在紫外灯下方照射30～60s，(2)避光搅拌20～30min，(3)在紫外灯下方照射15～30s，(4)避光搅拌15～20min，得到诱变花粉溶液；
其中，所述ems-石蜡油溶液是ems、水和石蜡油按照0.05～0.06:2:50的体积比例混合制成的；
s3，人工授粉
人工授粉前30～60mim，在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液，得到诱变处理花丝，然后进行人工授粉，人工授粉时将s2的诱变花粉溶液均匀刷在诱变处理花丝上，套袋，正常田间管理直至收获玉米，得到玉米突变体。
优选的，上述利用ems诱变产生玉米突变体的方法，s1中，处于散粉早期玉米是指即将散粉或者刚开始散粉2d内的玉米。
优选的，上述利用ems诱变产生玉米突变体的方法，s2中，(1)和(3)是将花粉置于15w紫外灯正下方30cm处照射。
优选的，上述利用ems诱变产生玉米突变体的方法，s2中，每5～10mlems-石蜡油溶液加入1g除掉花药的花粉。
优选的，上述利用ems诱变产生玉米突变体的方法，s2中，搅拌转速为500～1000r/min。
优选的，上述利用ems诱变产生玉米突变体的方法，s3中，待玉米的花丝抽出1～2d后的下午6:00对花丝进行整理，第二天中午11:30在雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液，中午12:00进行人工授粉。
与现有技术相比，本发明提供的利用ems诱变产生玉米突变体的方法具有以下有益效果：
1、本发明利用紫外与ems的诱变机理不同，对dna和细胞造成不同类型的损伤，将两种诱变方式相结合，通用性良好，还对花丝进行了诱变处理，使雌蕊中部分基因发生突变，故突变率较高。
2、花粉收集期、紫外处理方式、诱变剂用量、搅拌转速、人工授粉时间对玉米突变效率均有影响，花粉收集期推迟、长时间或者高功率的紫外照射、高搅拌转速、人工授粉时间推迟都会降低突变率，故本发明实施例的技术方案为最佳。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
下述实施例中，实验材料为四川农大正红生物可以有限公司提供的玉米自交系k305、r08、21-es、w64a和p167。
本发明提供的一种利用ems诱变产生玉米突变体的方法，包括以下步骤：
s1，花粉收集
给处于散粉早期玉米的雄穗套袋，收集玉米花粉；
选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋，避免雌穗授粉，得到待授粉玉米植株；
s2，花粉诱变处理
配制ems-石蜡油溶液，将s1收集的花粉用筛网除掉花药后，加入到ems-石蜡油溶液中，按以下步骤进行诱变：(1)在紫外灯下方照射30～60s，(2)避光搅拌20～30min，(3)在紫外灯下方照射15～30s，(4)避光搅拌15～20min，得到诱变花粉溶液；
其中，所述ems-石蜡油溶液是ems、水和石蜡油按照0.05～0.06:2:50的体积比例混合制成的；配制时先将称取的ems和水混合，然后加入称取的石蜡油，混匀，现配现用；
s3，人工授粉
人工授粉前30～60mim，在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液(将玉米花丝浸湿即可)，得到诱变处理花丝，然后进行人工授粉，人工授粉时用柔软的毛刷蘸取s2的诱变花粉溶液，均匀刷在诱变处理花丝上，套袋，进行套代标记，正常田间管理直至收获玉米，得到玉米突变体。
具体包括以下实施例。
实施例1
一种利用ems诱变产生玉米突变体的方法，包括以下步骤：
s1，花粉收集
给处于即将散粉玉米的雄穗套袋，收集玉米花粉；
选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋，避免雌穗授粉，得到待授粉玉米植株；
s2，花粉诱变处理
配制ems-石蜡油溶液，将s1收集的花粉用筛网除掉花药后，加入到ems-石蜡油溶液中，每5mlems-石蜡油溶液加入1g除掉花药的花粉，按以下步骤进行诱变：(1)在15w紫外灯正下方30cm处照射60s，(2)避光500r/min搅拌30min，(3)在15w紫外灯正下方30cm处照射15s，(4)避光500r/min搅拌15min，得到诱变花粉溶液；
其中，所述ems-石蜡油溶液是ems、水和石蜡油按照0.05:2:50的体积比例混合制成的；
s3，人工授粉
待玉米的花丝抽出1d后的下午6:00对花丝进行整理，第二天中午11:30在雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液，中午12:00进行人工授粉；即人工授粉前30mim，在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液(将玉米花丝浸湿即可)，得到诱变处理花丝，然后进行人工授粉，人工授粉时用柔软的毛刷蘸取s2的诱变花粉溶液，均匀刷在诱变处理花丝上，套袋，进行套代标记，正常田间管理直至收获玉米，得到玉米突变体。
实施例2
一种利用ems诱变产生玉米突变体的方法，包括以下步骤：
s1，花粉收集
给处于刚开始散粉2d内玉米的雄穗套袋，收集玉米花粉；
选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋，避免雌穗授粉，得到待授粉玉米植株；
s2，花粉诱变处理
配制ems-石蜡油溶液，将s1收集的花粉用筛网除掉花药后，加入到ems-石蜡油溶液中，每10mlems-石蜡油溶液加入1g除掉花药的花粉，按以下步骤进行诱变：(1)在15w紫外灯正下方30cm处照射30s，(2)避光1000r/min搅拌20min，(3)在15w紫外灯正下方30cm处照射20s，(4)避光1000r/min搅拌20min，得到诱变花粉溶液；
其中，所述ems-石蜡油溶液是ems、水和石蜡油按照0.06:2:50的体积比例混合制成的；
s3，人工授粉
待玉米的花丝抽出2d后的下午6:00对花丝进行整理，第二天中午11:00在雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液，中午12:00进行人工授粉；即人工授粉前60mim，在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液(将玉米花丝浸湿即可)，得到诱变处理花丝，然后进行人工授粉，人工授粉时用柔软的毛刷蘸取s2的诱变花粉溶液，均匀刷在诱变处理花丝上，套袋，进行套代标记，正常田间管理直至收获玉米，得到玉米突变体。
实施例3
一种利用ems诱变产生玉米突变体的方法，包括以下步骤：
s1，花粉收集
给处于即将散粉玉米的雄穗套袋，收集玉米花粉；
选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋，避免雌穗授粉，得到待授粉玉米植株；
s2，花粉诱变处理
配制ems-石蜡油溶液，将s1收集的花粉用筛网除掉花药后，加入到ems-石蜡油溶液中，每8mlems-石蜡油溶液加入1g除掉花药的花粉，按以下步骤进行诱变：(1)在15w紫外灯正下方30cm处照射45s，(2)避光600r/min搅拌30min，(3)在15w紫外灯正下方30cm处照射20s，(4)避光600r/min搅拌16min，得到诱变花粉溶液；
其中，所述ems-石蜡油溶液是ems、水和石蜡油按照0.05:2:50的体积比例混合制成的；
s3，人工授粉
待玉米的花丝抽出1d后的下午6:00对花丝进行整理，第二天中午11:30在雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液，中午12:00进行人工授粉；即人工授粉前30mim，在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液(将玉米花丝浸湿即可)，得到诱变处理花丝，然后进行人工授粉，人工授粉时用柔软的毛刷蘸取s2的诱变花粉溶液，均匀刷在诱变处理花丝上，套袋，进行套代标记，正常田间管理直至收获玉米，得到玉米突变体。
下面以实施例1为例，说明本发明方法的效果。
一、不同诱变方式效果评价
(1)分组设计
对照组：不做诱变处理，s3，人工授粉时涂抹的是石蜡油。实验组1组：处理方式同实施例1。实验2组：s2按以下步骤进行诱变：避光500r/min搅拌45min，得到诱变花粉溶液；其余步骤同实施例1。实验3组：s3取消人工授粉前30mim，在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹ems-石蜡油溶液的步骤；其余步骤同实施例1。
实验材料为四川农大正红生物可以有限公司提供的玉米自交系k305、r08、21-es、w64a和p167。
(2)诱变后代处理：上述分组收获时统计玉米的结实率，得m0；种植m0种子，行宽3米，行距0.8米，每行10穴，每穴3粒种子，每个分组各种植6行，记录诱变处理后玉米的结实率，观察m0种子的出苗率、苗高、果穗性状，记录突变频率。
(3)结果与分析
不同诱变方式处理玉米后，结实率如表1所示，结果显示，同时经紫外诱变处理和ems诱变处理后，实验1-3组的结实率介于50.08～68.16％之间，均是适合进行花粉诱变的适宜处理方式，且实验1组的方法效果明显。
表1不同诱变方式结实率
m0种子田间种植后出现了各种变异植株，主要包括矮化株(成株高度50cm左右)、果穗突变株(雄花不育、雄花结实、无雄穗、雌穗生长在植株顶部)、叶形突变株(叶片皱缩、叶色突变为白色或者黄色)，其中雄穗果穗突变频率较高。不同处理方式的出苗率和突变率如表2所示。表2结果显示，对于不同的玉米自交系品种，实验1组的突变率介于10.00～11.41％，且高于其他组，各自交系之间差别不大，说明交替使用紫外诱变和ems诱变，既可以增加突变率，而且适用于不同自交系，适用范围广，本发明利用紫外与ems的诱变机理不同，对dna和细胞造成不同类型的损伤，将两种诱变方式相结合，效果良好。由实验2组的数据可以看出，虽然采用相同的诱变方式，但是不同自交系之间的突变率差别较大(p<0.05)，可能的原因是不同自交系之间的基因分布不同，对ems的抗性也不同，因此表现出的突变率差别较大。实验3组的突变率普遍低于实验1组的突变率，原因是，实验1组还对花丝进行了诱变处理，使雌蕊中部分基因发生突变，故突变率较高，实验3组仅采用通用的花粉诱变处理，诱变部位较少，故突变频率低。
表2不同诱变方式出苗率和突变率
二、其他因素(花粉收集期、紫外处理方式、诱变剂用量、搅拌转速、人工授粉时间)对突变率的影响。试验材料为k305，实验方法同实施例1，区别在于将花粉收集期、紫外处理方式、诱变剂用量、搅拌转速、人工授粉时间进行了适当改变，记录的突变率如表3所示。
表3其他因素对突变率的影响
考察不同花粉收集期对突变率的影响，结果显示，当玉米开始散粉第3d收集的花粉进行诱变和人工授粉，发现突变率降低，原因是第3d后部分花粉散失，花粉的总量减少。考察不同紫外处理方式对突变率的影响，相比于实施例1的紫外处理条件(15w紫外灯正下方30cm处照射60s)，长时间或者高功率的紫外照射，均是突变率降低，考虑原因是长时间或者高功率的紫外照射是部分花粉致死。考察不同诱变剂用量对突变率的影响，结果显示，诱变剂用量对突变率影响不大，随着诱变剂用量的增加，突变率稍有降低，但是考虑到诱变剂的致癌危险性，应当选取较少的量。考察不同搅拌转速对突变率的影响，结果显示，大于1000r/min的转速条件，则突变率降低，考虑原因是转速过大造成dna损伤。考察不同人工授粉时间对突变率的影响，玉米的花丝抽出3d后突变率降低，考虑原因是，花丝抽出时间过长，错过了最佳授粉时机，影响了dna的结合。综上，实施例1的技术方案为最佳方案。
需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例及效果，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。