本发明涉及生物技术领域，具体来一种黄精叶片的离体再生培养方法。
背景技术：
黄精系百合科黄精属多年生草本植物滇黄精（p.kingianumcoll.ethemsl）、黄精（polygonatumsibiricumred.）或多花黄精（polygonatumcyrtonemahua）的干燥根茎，为名贵中药，具有宽中益气、益肾填精、滋阴润肺、生津补脾之功效。主治肺燥干咳、体虚乏力、心悸气短、久病津亏口干、糖尿病、高血压等病症。对治疗心血管疾病、结核病、慢性肝炎以及在抗菌、解毒、抗疲劳、抗衰老、降血糖、降血脂、抗肿瘤等方面均有较好的作用。
黄精既可入药，又可作为保健食品，是延年益寿的佳品，在食品领域具有很大的发展前景，其需求量越来越大，野生黄精的数量远不能满足市场需求，人工种植已成为黄精发展的一个主要内容。在自然条件下，黄精靠种子和根茎进行繁殖，由于种子不易采收，发芽率低，根茎繁殖成本高，于是植物组培技术在黄精规模化育苗方面有了很好的应用。
目前，在黄精组织培养领域公开了许多专利，大多集中于以黄精根茎和种子为外植体的诱导方法，所采用激素包括6-ba、tdz、2,4-d、naa和iaa等，为黄精组培苗的生产提供了很多依据。但是不管是采用种子或者根茎等繁殖的方法，均存在周期长，成本高等问题。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种黄精叶片的离体再生培养方法，利用叶片作为材料实现黄精的快繁繁殖。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种黄精叶片的离体再生培养方法，步骤包括：
（1）外植体选择：选择组培中处于增殖阶段的丛苗，挑选长条形大苗或细针形小芽为培养材料；
（2）不定芽诱导：将步骤（1）选择的外植体材料的叶片从基部切下，接入不定芽培养基，接种时叶片横放，使基部切口的一半接入培养基中，另一半露在培养基外面，培养30-60天；
所述不定芽培养基为：ms、cppu0.5-4mg/l、2,4-d0-1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（3）丛生芽增殖：将上一步诱导的不定芽进行切分，单个接入增殖培养基中，培养30-35天；
所述增殖培养基为：ms、cppu0-2mg/l、2,4-d0-0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（4）生根培养：将增殖的丛芽2-3个为一组切下，接种至生根培养基，进行生根培养13-15天；
所述生根培养基为：1/2ms、naa0-1mg/l、iba0-1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（5）炼苗移栽：待组培苗根长2-4cm，根数3-6根时，将瓶子放置在炼苗棚中培养1周后打开瓶盖，适量喷水培养3天后移栽至炼苗基质中。
进一步的，步骤（1）中，选择的外植体为长条形大苗。
进一步的，步骤（2）中，不定芽培养时，培养条件为温度23±1℃、空气相对湿度50%-60%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天。
进一步的，步骤（3）中，丛生芽培养时，培养条件为温度23±1℃、空气相对湿度50%-60%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天。
进一步的，步骤（4）中，生根培养时，培养条件为温度23±1℃、空气相对湿度50%-60%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天。
进一步的，步骤（5）中，所述炼苗基质为泥炭土、珍珠岩或蛭石和细沙，其重量比为5:3:2。
本发明的有益技术效果是：在本发明的技术方案中，外植体选用组培中处于增殖阶段的长条形大苗或细针形小芽为外植体，通过配制全新培养基，可快速实现黄精的繁殖，可重复性高，取材易得，操作简便，繁殖效率高，大大突破了黄精组培中再生材料单一用根茎及顶芽繁殖的瓶颈问题，可从根本上解决黄精种质退化及常规繁育中周期长、繁殖率低等问题，培养出来的不定芽数目多、质量好、健壮、没有畸形，为满足市场需求、缓解生态压力及工厂化、规范化苗木生产奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1挑选的长条形大苗培养材料；
图2是本发明实施例2挑选的细针形小芽培养材料。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种黄精叶片的离体再生培养方法，步骤包括：
（1）外植体选择：选择组培中处于增殖阶段的丛苗，挑选长条形大苗为培养材料（如图1所示）；
（2）不定芽诱导：将步骤（1）选择的外植体材料的叶片从基部切下，接入不定芽培养基，接种时叶片横放，使基部切口的一半接入培养基中，另一半露在培养基外面，培养条件为温度23℃、空气相对湿度50%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养30天；
不定芽培养基为：ms、cppu0.5-4mg/l、2,4-d0-1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（3）丛生芽增殖：将上一步诱导的不定芽进行切分，单个接入增殖培养基中，培养条件为温度22℃、空气相对湿度55、光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养30天；
增殖培养基为：ms、cppu0-2mg/l、2,4-d0-0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（4）生根培养：将增殖的丛芽2个为一组切下，接种至生根培养基，进行生根培养，培养条件为温度22℃、空气相对湿度50%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养13天；
所述生根培养基为：1/2ms、naa0-1mg/l、iba0-1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（5）炼苗移栽：待组培苗根长2cm，根数3根时，将瓶子放置在炼苗棚中培养1周后打开瓶盖，适量喷水培养3天后移栽至炼苗基质中，所述炼苗基质为泥炭土、珍珠岩或蛭石和细沙，其重量比为5:3:2。
实施例2
一种黄精叶片的离体再生培养方法，步骤包括：
（1）外植体选择：选择组培中处于增殖阶段的丛苗，挑选细针形小芽为培养材料（如图2所示）；
（2）不定芽诱导：将步骤（1）选择的外植体材料的叶片从基部切下，接入不定芽培养基，接种时叶片横放，使基部切口的一半接入培养基中，另一半露在培养基外面，培养条件为温度23℃、空气相对湿度50%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养30天；
所述不定芽培养基为：ms、cppu0.5-4mg/l、2,4-d0-1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（3）丛生芽增殖：将上一步诱导的不定芽进行切分，单个接入增殖培养基中，培养条件为温度23±1℃、空气相对湿度50%-60%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养30-35天；
所述增殖培养基为：ms、cppu0-2mg/l、2,4-d0-0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（4）生根培养：将增殖的丛芽2-3个为一组切下，接种至生根培养基，进行生根培养，培养条件为温度23℃、空气相对湿度55%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养14天；
所述生根培养基为：1/2ms、naa0-1mg/l、iba0-1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（5）炼苗移栽：待组培苗根长3cm，根数5根时，将瓶子放置在炼苗棚中培养1周后打开瓶盖，适量喷水培养3天后移栽至炼苗基质中，所述炼苗基质为泥炭土、珍珠岩或蛭石和细沙，其重量比为5:3:2。
实施例3
一种黄精叶片的离体再生培养方法，步骤包括：
（1）外植体选择：选择组培中处于增殖阶段的丛苗，挑选长条形大苗为培养材料；
（2）不定芽诱导：将步骤（1）选择的外植体材料的叶片从基部切下，接入不定芽培养基，接种时叶片横放，使基部切口的一半接入培养基中，另一半露在培养基外面，培养条件为温度24℃、空气相对湿度60%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养60天；
所述不定芽培养基为：ms、cppu0.5-4mg/l、2,4-d0-1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（3）丛生芽增殖：将上一步诱导的不定芽进行切分，单个接入增殖培养基中，丛生芽培养时，培养条件为温度24℃、空气相对湿度60%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养35天；
所述增殖培养基为：ms、cppu0-2mg/l、2,4-d0-0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（4）生根培养：将增殖的丛芽3个为一组切下，接种至生根培养基，进行生根培养15天，培养条件为温度24℃、空气相对湿度60%、光照强度2000lx，光照时间12小时/天；
所述生根培养基为：1/2ms、naa0-1mg/l、iba0-1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.5g/l，ph为5.8；
（5）炼苗移栽：待组培苗根长4cm，根数6根时，将瓶子放置在炼苗棚中培养1周后打开瓶盖，适量喷水培养3天后移栽至炼苗基质中，炼苗基质为泥炭土、珍珠岩或蛭石和细沙，其重量比为5:3:2。
通过上述实施例1-3，能快速缩短黄精繁殖时间，90-120天即可实现黄精的繁殖，大大缩短了繁殖时间，通过组培苗叶片进行繁殖，能快速实现扩繁。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。