本发明属于细胞保存领域，具体涉及一种神经干细胞球玻璃化冻存/复苏方法。
背景技术：
细胞冻存是将细胞储存于低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，利用冻存技术将细胞置于液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
实验室培养的细胞在放于液氮或超低温冰箱之前，需首先按照适宜的程序进行降温过程，方能最大限度的防止细胞损伤，降低细胞在降温环节中受到的冰晶损伤、溶质损伤。当前广泛使用的细胞冷冻程序主要包括两种：程序降温即慢速冷冻以及玻璃化冷冻。两者共同点为都需要使用渗透型及非渗透型冷冻保护剂以减少细胞内外在降温过程中的冰晶形成及因温度降低导致溶液中离子浓度增加而对细胞形成的溶质损伤。其中慢速冷冻发展较早，技术成熟，细胞添加冷冻保护剂后使用程序降温仪或程序降温盒按照既定程序缓慢降温，达到-80℃后转入液氮长期保存，目前已在大部分类型细胞冻存中取得了良好的效果；而玻璃化冻存则是一种快速冷冻技术，将细胞或组织添加高浓度冷冻保护剂后直接投入液氮，在极快的降温过程中，使高浓度的冷冻保护剂变为粘度很强的玻璃化状态，避免了细胞内外冰晶的形成，达到保护细胞的目的，显著提高存储细胞的复苏率。然而玻璃化冻存需要采用特殊装置，如冷冻环、铜网、拉细麦管等，冻存细胞量有限、操作较复杂，而且有些耗材价格昂贵，近年来主要在胚胎、卵母细胞、精子等辅助生殖领域应用。
神经干细胞是中枢神经系统内是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞体外培养技术为帕金森症、老年痴呆症、脑瘫等疾病的细胞移植治疗提供了可能。当前神经干细胞体外培养主要有两种方法：神经干细胞球法和贴壁法。神经干细胞球法即悬浮培养法是神经干细胞培养的经典方法，因神经干细胞本身特性，在培养过程中神经干细胞会自发聚集成球并不断扩增；贴壁法则是在培养过程中用黏附因子包被培养瓶，使细胞单层贴壁培养。其中神经干细胞球法因其易操作、高密度培养、不易分化等特点，目前仍是神经干细胞体外培养的主流方法。
神经干细胞体外培养时较其他类型干细胞脆弱，冻存复苏过程细胞损失率大。神经干细胞球培养法为悬浮培养，冻存时可选择细胞生长对数期、活性高阶段，无需酶解直接冻存，有效避免损伤，并提高冻存密度。然而，用传统方法冻存，低浓度保护剂难以有效渗透至细胞球内部，冻存过程内部细胞损伤极大。而采用酶解或机械剪切方法处理细胞球又会给细胞造成较大损伤，得不偿失。神经干细胞冻存复苏问题一直给科研人员造成极大困扰。因此，理想的神经干细胞冻存方法应该做到：无需酶解、冻存保护剂有效渗透进入细胞内部、设计简便装置用玻璃化冻存代替慢速降温。目前尚无神经干细胞球相关玻璃化冻存方法与配套仪器的报道。
技术实现要素：
针对神经干细胞球在冻存过程中，冻存保护剂难以渗透进入细胞球内部，降温过程中内部细胞损伤大等问题，本发明提供一种神经干细胞球玻璃化冻存及复苏方法，细胞复苏率高、复苏后活性好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种神经干细胞球玻璃化冻存及复苏方法，包括以下步骤：
（1）神经干细胞悬浮培养成神经干细胞球；
（2）使步骤（1）的神经干细胞球贴附于细胞球收集片；
（3）将步骤（2）的细胞球收集片于冻存液中孵育；
（4）将步骤（3）的细胞球收集片液氮冷冻，然后转入冻存管中于液氮中保存；
（5）将步骤（4）中的细胞球收集片在复苏培养基中孵育复苏，以神经干细胞完全培养基培养后传代，按照正常方式培养、传代。
所述细胞球收集片，包括贴壁面和支架；所述贴壁面为长方形；所述支架与贴壁面的短边垂直相连，呈l型；所述支架高度小于贴壁面长度，使所述贴壁面与水平面呈一定角度。所述贴壁面与水平面的角度优选为15°-30°。所述贴壁面的长为10-25mm，优选为15-20mm；所述贴壁面的宽为3-8mm，优选为3.5-5mm。所述细胞球收集片由玻璃或塑料制成；所述塑料优选为聚苯乙烯塑料。
所述步骤（1）中神经干细胞球的平均直径为120-180μm。
所述步骤（2）的细胞球收集片经贴壁包被处理。所述贴壁包被处理可以选择本领域常用的贴壁包被剂以本领域常规包被操作进行；在本发明的一个实施例中，包被液为0.01%poly-ornithine溶液和10mg/llaminin溶液；先用0.01%poly-ornithine溶液按0.1ml/cm2包被，37℃，1h，pbs（ph7.4）漂洗两遍；然后用10mg/llaminin溶液按1.5μg/cm2包被，37℃，2h，pbs漂洗两遍。
所述步骤（3）中的冻存液为两种或两种以上冻存保护剂浓度递增的培养基。所述步骤（5）中复苏培养基为为两种或两种以上冻存保护剂浓度递减的培养基。上述冻存保护剂为干细胞玻璃化冻存中的常用冻存保护剂，如，羟乙基淀粉、二甲基亚砜、乙二醇、蔗糖。
所述步骤（5）中神经干细胞完全培养基为神经干细胞培养常用无血清培养基，可以商业化购买或者配制；在本发明的一个实施例中，为添加了20ng/mlegf，20ng/mlbfgf的含1倍b27的neurobasal培养基。
作为优选，所述步骤（3）中冻存液为2个浓度；步骤为将细胞球收集片在低浓度冻存液中孵育1min，然后在高浓度冻存液中孵育25s，然后用高浓度冻存液滴洗细胞球收集片。
所述步骤（4）中细胞球收集片置于医用液氮中冷冻5-10s。
作为优选，所述步骤（5）中复苏培养基为3个浓度；步骤为细胞球收集片于高浓度复苏培养基中孵育1min后，再于低浓度复苏培养基中孵育5min，再转移到低浓度复苏培养基中孵育2次，每次5min。
所述步骤（5）中神经干细胞完全培养基为神经干细胞培养常用培养基，在本发明的一个实施例中，为添加了20ng/mlegf，20ng/mlbfgf的含1倍b27的neurobasal培养基。
本发明具有以下优点：
本发明提供的神经干细胞球玻璃化冻存和复苏方法，可将神经干细胞球高密度束缚于一个较小的贴壁面，达到了玻璃化冻存的前提条件，并且细胞球摊开贴壁有效减小了神经球的厚度，提高了冻存保护剂的渗透效率。神经干细胞冻存复苏后复苏率达到85%以上，并且继续传代效果未受影响。本发明提供的神经干细胞球收集片，结构简单实用，最大限度的提高神经干细胞与液氮的接触，实现了超速降温，细胞低温损伤降低、复苏率大大提高。本发明的冷冻、复苏培养基配方简单，不含血清成分，有效防止神经干细胞分化。采用本发明的神经干细胞球玻璃化冻存和复苏方法和装置，能够高效的完成神经干细胞的玻璃化冻存。
附图说明
图1为实施例1细胞球收集片侧面示意图；
图2为细胞球收集片正面示意图；
图3为神经干细胞球贴附于细胞球收集片显微图片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1用于神经干细胞球玻璃化冻存的细胞球收集片。
如附图1和附图2所示的细胞球收集片，包括贴壁面（1）和支架（2）；所述贴壁面（1）为20mm×3.5mm的长方形；所述支架（2）与贴壁面（1）的短边垂直相连，呈l型；所述支架（2）高度小于贴壁面（1）长度，使所述贴壁面（1）与水平面呈15°角。所述细胞球收集片由聚苯乙烯制成，表面经tc处理后γ-射线辐照灭菌。
细胞球收集片提前包被：先用0.01%poly-ornithine按0.1ml/cm2包被，37℃，1h。pbs洗两遍，然后用10mg/llaminin溶液按1.5μg/cm2包被，37℃，2h，pbs洗两遍。
实施例2神经干细胞球玻璃化冻存与复苏。
2.1培养基的制备
神经干细胞完全培养基（含1倍b27、20ng/mlegf，20ng/mlbfgf的neurobasal培养基）及dmem/f12（含hepes缓冲液）培养基通过市购获得；按照下述含量分别配置不同培养基：
冻存液1为添加了1.2%hes（羟乙基淀粉）、10%dmso和10%eg(乙二醇)的含1倍hepes缓冲液的dmem/f12培养基；
冻存液2为添加了1.2%hes（羟乙基淀粉）、20%dmso、20%eg(乙二醇)和0.5mol/l蔗糖的含1倍hepes缓冲液的dmem/f12培养基；
复苏培养基1为添加了1.2%hes（羟乙基淀粉）和0.2mol/l蔗糖的含1倍hepes缓冲液的dmem/f12；
复苏培养基2为添加了1.2%hes（羟乙基淀粉）和0.1mol/l蔗糖的含1倍hepes缓冲液的dmem/f12；
复苏培养基3为添加了1.2%hes（羟乙基淀粉）的含1倍hepes缓冲液的dmem/f12。
2.2神经干细胞球培养
（1）将神经干细胞完全培养基及dmem/f12（含hepes缓冲液）提前放到37℃水浴锅中温浴，注意防止水面高于瓶肩，100ml液体保持10min，200ml液体保持15min，500ml液体保持20min，间或摇动；
（2）用酒精消毒冻存管，擦拭干净后转移到生物安全柜中，吸取1.0ml细胞滴加至的19mldmem/f12培养基中，400g离心5min；
（3）弃上清，吸干离心后管内的残留液体，加入神经干细胞完全培养基15ml重悬细胞沉淀，调整细胞密度，在每个t75培养瓶接种细胞5×106个；
（4）在培养瓶上做好标记，于37℃、5%co2培养箱中静止培养；
（5）第三天取出培养瓶倾斜放置，待细胞沉淀后，2/3换液；
（6）第七天观察细胞球平均直径在150μm时，低速离心，吸出10ml上清液丢弃，剩余5ml混匀，吸取1ml，用accutase消化成单细胞计数；其余4ml铺至另一新的t25培养瓶。
2.3神经干细胞球玻璃化冻存
（1）将实施例1中的细胞球收集片放置于t25培养瓶底部，细胞球收集片支架的直角与培养瓶瓶底直角对齐，每t25培养瓶放置3片细胞球收集片，然后置于co2培养箱培养，培养瓶倾斜放置使液体尽量集中于细胞球收集片附近，培养3h。然后取出培养瓶，用无菌镊子将细胞球收集片翻面，使另一面朝上，细胞球收集片支架下边缘抵住培养瓶底部拐角处，然后置于co2培养箱培养，培养瓶倾斜放置使液体尽量集中于细胞球收集片附近，培养3h；神经干细胞球在培养过程中，较大的球无法悬浮沉于瓶底，较小球可以悬浮；l型的细胞球收集片首先贴壁收集在底部的大球，然后再翻转后收集悬浮的小球，同时能够防止挤压大球造成损伤；细胞球收集片的显微图片如图3所示：神经干细胞球贴附于细胞球收集片两面，且细胞一定程度摊开成平面；
（2）用无菌镊子取出步骤（7）中的细胞球收集片，先在冻存液1中孵育1min，然后在冻存液2中孵育25s，然后用1ml冻存液2滴洗细胞球收集片；
（3）快速将细胞球收集片置于医用液氮中速冻10s，然后将细胞球收集片置于提前预冷冻过的2ml冻存管，拧紧盖子放入气相液氮罐长期存储。
2.4玻璃化冻存神经干细胞球复苏
（1）神经干细胞球完全培养基、解冻液提前37℃孵育；
（2）从气相液氮罐中取出冻存6个月后的3.3中的冻存管，于生物安全柜中快速取出细胞球收集片插入复苏培养基1中，孵育1min后，再将细胞球收集片插入复苏培养基2孵育5min，再转移到复苏培养基3中孵育2次，每次5min，然后置于15ml神经干细胞完全培养基中，一起转移到t25培养瓶。转入co2培养箱培养，培养瓶倾斜放置使液体没过细胞球收集片，复苏24h；
（3）取出细胞球收集片，用accutase消化酶解，细胞计数，按每个t75培养瓶接种细胞5×106重新铺瓶培养，正常传代培养。
实施例3神经干细胞球玻璃化冻存与复苏后活性。
采用常用程序降温法冻存并复苏与实施例3同批神经干细胞，冻存6个月后复苏。
以台盼蓝（trypanblue）法检测实施例3与常用程序降温法冻存的神经干细胞球在冻存前及复苏后细胞数及细胞活率；并连续传代5次，观察并计算细胞传代周期及增值率。由表1-3数据可知，神经干细胞球玻璃化冻存复苏后平均复苏率达到85%以上；且细胞传代周期及增值率与冻存前无明显差异；各项数据优于目前程序降温法冻存后复苏的细胞。
表1不同冻存与复苏方法的复苏率
表2不同冻存与复苏方法的复苏后细胞传代周期
表3不同冻存与复苏方法的复苏后细胞增值率