本发明属于植物组织培养
技术领域：
，尤其是一种卷叶黄精的组培快繁方法。
背景技术：
：卷叶黄精(Polygonatumcirrhifolium)，属于百合科(Liliaceae)黄精属(Ploygonatum)多年生草本植物，为常用药食同源中药，藏名译音“可口梨”。性味甘平，具有补气养阴、降血压、降血糖、降血脂、润肺、益肾、健脾等功效，被誉为“长生不老和延年益寿”药。汉朝的《神农本草经》、明朝的《本草纲目》和藏医名著《晶珠本草》均有其药膳食补功效的记载。黄精主要含有多糖、皂甙、生物碱、氨基酸、木脂素、黄酮、酚类、蒽醌等多种化学成分。本发明采用组织培养的方法，能快速、有效地提高卷叶黄精种苗的繁殖效率和质量，实现卷叶黄精优质种苗的工厂化育苗，满足生产上的需要。但鲜有相关报道公开于该
背景技术：
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种卷叶黄精的组培快繁方法，本发明的方法采用四种特制的培养基进行组织培养，可有效提高卷叶黄精种苗的繁殖速度和质量，实现优质卷叶黄精种苗的工厂化育苗。本发明是通过以下技术方案来实现的：一种卷叶黄精的组培快繁方法，包括如下步骤：(1)取卷叶黄精侧芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；(2)将步骤(1)得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；(3)将步骤(2)得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮植株；(4)将步骤(3)得到的健壮植株置于第四培养基中培养，得完整带根苗；(5)将步骤(4)得到的完整带根苗连同培养瓶一起放入25℃的环境中，打开培养瓶盖，向培养瓶内添加自来水，炼苗4-7天，待完整带根苗的表面角质形成后取出，洗净根部培养基后移栽至椰糠基质中。作为优选，步骤(1)中，将外植体置入第一培养基之前，对外植体进行消毒处理，所述消毒处理的具体步骤包括：(a)将外植体置入体积分数为1.5-3％的洗洁精水溶液中浸泡3-7min，取出后用线状自来水冲洗15-30min；(b)将步骤(a)得到的外植体置入特制消毒剂中浸泡8-10min，取出后用无菌水冲洗3-5次；其中，所述特制消毒剂为在质量分数为0.1％的升汞溶液中添加吐温-20得到，每100mL质量分数为0.1％的升汞溶液添加的吐温-20的量为2-3滴。作为优选，步骤(1)中所述的第一培养基包括：MS、1.0-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.1-0.3mg/L的吲哚乙酸、25-35g/L蔗糖和4.5-5.5g/L的琼脂。作为优选，步骤(2)中所述的第二培养基包括：MS、1.0-5.0mg/L的甲硫达嗪、0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸、0.2-1.0mg/L的激动素、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂。作为优选，步骤(3)中所述的第三培养基包括：MS、0.1-0.5mg/L的萘乙酸、0.5-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂。作为优选，步骤(4)中所述的第四培养基包括：1/2MS、0.5-2.0mg/L的萘乙酸、8-12g/L蔗糖和5g/L的琼脂。作为优选，在第一培养基中培养的培养条件：培养温度为23-27℃，光照强度为1200-1800lux，光照时间为8-10小时/天；在第二培养基中培养的培养条件：培养温度为23-27℃，光照强度为1200-1800lux，光照时间为8-10小时/天；在第三培养基中培养的培养条件：培养温度为23-27℃，光照强度为1200-1800lux，光照时间为8-10小时/天；在第四培养基中培养的培养条件：培养温度为23-27℃，光照强度为1200-1800lux，光照时间为8-10小时/天。作为优选，在所述的第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基中的培养时间分别为25-35天、35-45天、25-35天和25-35天。作为优选，所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基的初始pH值均为5.5-6.0。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明采用四种针对性强的第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基进行组织培养，在短时间内可以培养出大量可供大秒栽培的卷叶黄精幼苗，显著提高了卷叶黄精种苗的繁殖系数和种苗质量，可以实现了规模化生产，以满足生产上的需要。(2)本发明首先用第一培养基进行外植体初代诱导获得无菌试管苗，然后用第二培养基进行无菌试管苗丛生芽快速繁殖培养分化出大量丛生芽获得试管丛生芽，随后用第三培养基进行丛生芽壮苗培养获得健壮的植株，最后用第四培养基进行生根培养获得完整带根苗，四种培养基环环相扣，配合紧密，极大提高了卷叶黄精成苗率。具体实施方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。实施例1一种卷叶黄精的组培快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体的选择与消毒：取卷叶黄精侧芽作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液泡5min、线状自来水冲洗15min、添加了2滴吐温-20的100mL0.1％升汞消毒8min、无菌水冲洗3次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于MS培养基中，在培养温度为23℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于花MS繁殖培养基中，在培养温度23℃、光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下培养40天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加了1.0mg/L的甲硫达嗪TDZ、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、1.0mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。丛生芽增殖系数为15.6。(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(5)生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中在培养温度23℃、光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下培养30天得到完整带根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、10g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(6)炼苗移栽：将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到灭过菌的椰糠基质中。实施例2一种卷叶黄精的组培快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体的选择与消毒：取卷叶黄精侧芽作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗30min、添加了3滴吐温-20的100mL0.1％升汞消毒10min、无菌水冲洗5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中的蒸馏水；(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于MS培养基中，在培养温度为27℃，光照强度1500lux，光照时间为10小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度27℃、光照强度1500lux，光照时间为10小时/天的条件下培养40天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加了3.0mg/L的甲硫达嗪TDZ、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的1.0mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。丛生芽增殖系数为23.2。(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度27℃，光照强度1500lux，光照时间为10小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中添加0.2mg/L的萘乙酸NAA、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(5)生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中在培养温度27℃、光照强度1500lux，光照时间为10小时/天的条件下培养30天得到完整带根苗，其中1/2MS生根培养基中添加1.0mg/L的萘乙酸NAA、10g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(6)炼苗移栽：将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗7天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到灭过菌的椰糠基质中。实施例3一种卷叶黄精的组培快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体的选择与消毒：取卷叶黄精侧芽作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗20min、添加了3滴吐温-20的100mL0.1％升汞消毒9min、无菌水冲洗4次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于MS培养基中，在培养温度为25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度25℃、光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养40天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加了2.5mg/L的甲硫达嗪TDZ、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.3mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。丛生芽增殖系数为27.1。(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(5)生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中在培养温度25℃、光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到完整带根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.8mg/L的萘乙酸NAA、10g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(6)炼苗移栽：将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗5天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到灭过菌的椰糠基质中。实施例4一种卷叶黄精的组培快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体的选择与消毒：取卷叶黄精侧芽作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗20min、添加了3滴吐温-20的100mL0.1％升汞消毒9min、无菌水冲洗4次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于MS培养基中，在培养温度为25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度25℃、光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养40天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加了2.5mg/L的甲硫达嗪TDZ、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.3mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。丛生芽增殖系数为35.2。(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(5)生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中在培养温度25℃、光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到完整带根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.8mg/L的萘乙酸NAA、10g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(6)炼苗移栽：将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗5天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到灭过菌的椰糠基质中。实施例5一种卷叶黄精的组培快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体的选择与消毒：取卷叶黄精侧芽作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗20min、添加了3滴吐温-20的100mL0.1％升汞消毒9min、无菌水冲洗4次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于MS培养基中，在培养温度为25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度25℃、光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养40天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加了2.5mg/L的甲硫达嗪TDZ、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.3mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。丛生芽增殖系数为37.5。(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(5)生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中在培养温度25℃、光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到完整带根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.8mg/L的萘乙酸NAA、10g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(6)炼苗移栽：将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗5天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到灭过菌的椰糠基质中。实施例6一种卷叶黄精的组培快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体的选择与消毒：取卷叶黄精侧芽作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗20min、添加了3滴吐温-20的100mL0.1％升汞消毒9min、无菌水冲洗4次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于MS培养基中，在培养温度为25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度25℃、光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养40天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加了2.5mg/L的甲硫达嗪TDZ、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.3mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。丛生芽增殖系数为25.4。(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(5)生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中在培养温度25℃、光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养30天得到完整带根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.8mg/L的萘乙酸NAA、10g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(6)炼苗移栽：将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗5天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到灭过菌的椰糠基质中。为了更好地说明本发明的实施效果，发明人提供比较实验如下：比较例1在对外植体进行消毒处理之前，不将外植体用海绵包裹，然后进行变温变压处理，其余参数与实例6中的完全相同，工艺过程也完全相同。比较例2在配制第二培养基时，控制甲硫达嗪的含量为0.1mg/L。其余参数与实例6中的完全相同，工艺过程也完全相同。按照实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、比较例1和比较例2中的方案分别对卷叶黄精进行组织培养，统计丛生芽增殖系数。然后，将一块大田分为8块区域，将实施例1-6及比较例1和比较例2的椰糠基质中的完整带根苗分别移栽到8块区域中，并统计成苗率。表1丛生芽增殖系数和成苗率测定处理丛生芽增殖系数成苗率(％)实施例115.687％实施例223.285％实施例327.185％实施例435.295％实施例537.596％实施例625.498％比较例18.073％比较例25.376％从表1可知，按照实施例1-6及比较例1和比较例2中的技术方案进行组织培养，与比较例1和比较例2相比，本发明的实施例1-6中方法的丛生芽增殖系数和成苗率均有较大的提高。而且，实施例6中由于对外植体进行变温变压处理，其丛生芽增殖系数和成苗率均高于比较例1，实施例6在配制第二培养基时，由于控制甲硫达嗪的含量为1mg/L，其丛生芽增殖系数和成苗率均高于比较例2。因此，进行变温变压处理与第二培养基中合适的甲硫达嗪的含量均能明显提高丛生芽增殖系数和成苗率。综上所述，本发明的组织快繁方法在短时间内可以培养出大量可供大秒栽培的卷叶黄精幼苗，显著提高了卷叶黄精种苗的繁殖系数和种苗质量，可以实现了规模化生产，以满足生产上的需要。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。当前第1页1 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