一种快速培育红叶红杆铁皮石斛纯化株系的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速培育红叶红杆铁皮石斛纯化株系的方法。

背景技术

铁皮石斛（dendrobiumofficinale）又名黑节草，是兰科石斛属（dendrobium）多年生附生草本植物，为我国名贵中药材。红叶红杆为铁皮石斛的重要的商品性状，红叶红杆铁皮石斛常较青杆铁皮石斛市场价格高1-2倍，二者在多糖组分及含量上也存在较大差异。商业化红叶红杆铁皮石斛的育种方式常以母株带有红叶红杆性状铁皮石斛的种子进行无菌播种获得，由于铁皮石斛杂合程度高，无论利用自交还是杂交，均难以在播种后代中获得性状一致的株系，导致所生产不同个体的种苗间差异显著。而在常规组培条件下，红叶红杆铁皮石斛性状难以得到充分表现，需通过室外的移栽环境再选取茎杆为外植体进行组培快繁，此方法虽可以获得性状一致的后代，但从杂交、移栽、选种到快繁的过程常需3-5年。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速培育红叶红杆铁皮石斛纯化株系的方法。

本发明利用低氮、强光、低温刺激于铁皮石斛幼苗阶段诱导红叶红杆性状表达，并利用瓶内切芽的方式快速纯化扩繁，可将育种周期缩短至2年以内，且株系个体间基因型一致，可立即于规模化生产中应用。

本发明公布了一种利用低氮、强光、低温刺激诱导于铁皮石斛幼苗阶段诱导红叶红杆性状表达，并利用瓶内切芽的方式快速纯化扩繁，从杂交后代快速培育红叶红杆铁皮石斛纯化株系的方法。

本发明是由以下技术方案实现的，其具体步骤如下：

（1）带有红叶红杆种质杂交铁皮石斛果实的获得

以带有红叶红杆种质的铁皮石斛为父本或母本，进行以人工授粉方式进行的杂交或自交，授粉后依照铁皮石斛常规栽培技术进行养护培养100-150d，摘取蒴果备用；

（2）无菌播种

将（1）所述蒴果表面灭菌后播种于无菌萌发培养基，置于24-26℃，12h/d光周期，2000-3000lx光照强度环境下培养45-60d；

（3）红叶红杆性状的瓶内诱导

从（2）所述培养产物挑取已分化成苗的0.5-2cm植株接种于红叶红杆性状诱导培养基，于置于夜温16℃，日温24-26℃，14-16h/d光周期，6000-8000lx光照强度环境培养45-60d；

（4）红叶红杆铁皮石斛的瓶内切芽快速纯化与扩繁

从（3）所述培养产物中挑取具有明显红叶红杆性状的铁皮石斛植株，切成0.5-1cm带芽茎段，于扩繁培养基，置于24-26℃，14-16h/d光周期，2000-3000lx光照强度，连续继代培养，继代周期为60-90d，繁殖系数可达4-6之间；

（5）红叶红杆铁皮石斛的生根培养

当（4）所述种苗累积到所需数量，将所扩繁种苗接种于生根培养基，置于24-26℃，14-16h/d光周期，2000-3000lx光照强度培养60-90d，完成红叶红杆铁皮石斛的快速纯化与扩繁。

步骤（2）中萌发培养基为1/2ms+naa0.1-0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（3）中红叶红杆性状诱导培养基为1/2ms+香蕉泥50-100g/l、蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（4）中扩繁培养基为1/2ms+naa0.1mg/l+6-ba0.5-2mg/l+ad0.5-1.0mg/l+香蕉泥50-100g/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（5）中生根培养基为1/2ms+naa0.3mg/l+iba0.3mg/l+6-ba0.1mg/l+香蕉泥50-100g/l+南瓜泥50-100g/l+蛋白胨1-2g/l+活性炭0.5-1g/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

缩写说明：naa：萘乙酸；6-ba：六氨基腺嘌呤；iba：吲哚丁酸；ad：硫酸腺嘌呤。

本发明的显著特点在于：

1、在常规组培条件下，红叶红杆铁皮石斛性状难以得到充分表现，需通过室外的移栽环境再选取茎杆为外植体进行组培快繁，此方法虽可以获得性状一致的后代，但从杂交、移栽、选种到快繁的过程常需3-5年。本发明利用本发明利用低氮、强光、低温环境条件刺激铁皮石斛幼苗阶段红叶红杆性状表达，有利红叶红杆铁皮石斛早期筛选，缩短育种进程。

2、在瓶内获得叶红杆铁皮石斛植株后，配合瓶内切芽快速纯化与扩繁，相较传统室外取外植体诱导具有不易污染损失材料，快速恢复生长，繁殖系数大，植株生长健壮，不易产生变异等特点，可在较短时间内获得大量优质种苗。

附图说明

图1红叶红杆种质铁皮石斛培养效果图；带有红叶红杆种质铁皮石斛在夜温16℃，日温24-26℃，14-16h/d光周期，6000lux光照强度环境培养60d结果。

图2通过纯化的红叶红杆石斛与绿叶绿杆铁皮石斛外观差异图。

图3红叶红杆铁皮石斛生根培养效果图。

具体实施方式

实施例1

1、带有红叶红杆种质杂交铁皮石斛果实的获得

筛选带有红叶红杆种质的铁皮石斛，进行以人工授粉方式进行的自交，授粉后依照铁皮石斛常栽培技术进行养护培养120d，摘取蒴果备用。

2、无菌播种

将1所述蒴果表面灭菌后播种于1/2ms+naa0.1mg/l，附加蔗糖20g/l、琼脂5.5g/l、ph5.6无菌萌发培养基，置于24-26℃，12h/d光周期，2000lux光照强度环境下培养60d。

3、红叶红杆性状的瓶内诱导

从2所述培养产物挑取已分化成苗的2cm植株接种于1/2ms，附加香蕉泥80g/l、蔗糖20g/l、琼脂5.5g/l、ph5.6红叶红杆性状诱导培养基，于置于夜温16℃，日温25℃，15h/d光周期，6000lux光照强度环境培养60d，结果见图1。

4、红叶红杆铁皮石斛的瓶内切芽快速纯化与扩繁

从3所述培养产物中挑取具有明显红叶红杆性状的铁皮石斛植株，切成0.5-1cm带芽茎段，于1/2ms+naa0.1mg/l+6-ba1mg/l，附加香蕉泥50g/l、蔗糖20g/l、琼脂5.5g/l、ph5.6扩繁培养基，置于25℃，15h/d光周期，2000lux光照强度，连续继代培养，继代周期为90d，结果见图2。

5、红叶红杆铁皮石斛的生根培养

当4所述种苗累积到所需数量，可将所扩繁种苗接种于1/2ms+naa0.3mg/l+iba0.3mg/l，附加香蕉泥100g/l、蔗糖20g/l、琼脂5.5g/l、ph5.6生根培养基，置于25℃，14-16h/d光周期，2500lx光照强度培养90d，完成红叶红杆铁皮石斛的快速纯化与扩繁，结果见图3。

成活率100%。

实施例2

（1）带有红叶红杆种质杂交铁皮石斛果实的获得

以带有红叶红杆种质的铁皮石斛为父本或母本，进行以人工授粉方式进行的杂交或自交，授粉后依照铁皮石斛常规栽培技术进行养护培养100d，摘取蒴果备用；

（2）无菌播种

将（1）所述蒴果表面灭菌后播种于无菌萌发培养基，置于24℃，12h/d光周期，3000lx光照强度环境下培养45d；

（3）红叶红杆性状的瓶内诱导

从（2）所述培养产物挑取已分化成苗的1cm植株接种于红叶红杆性状诱导培养基，于置于夜温16℃，日温24℃，14h/d光周期，8000lx光照强度环境培养45d；

（4）红叶红杆铁皮石斛的瓶内切芽快速纯化与扩繁

从（3）所述培养产物中挑取具有明显红叶红杆性状的铁皮石斛植株，切成0.5cm带芽茎段，于扩繁培养基，置于24℃，14h/d光周期，2000lx光照强度，连续继代培养，继代周期为60d，繁殖系数可达4-6之间；

（5）红叶红杆铁皮石斛的生根培养

当（4）所述种苗累积到所需数量，将所扩繁种苗接种于生根培养基，置于24℃，14h/d光周期，2000lx光照强度培养60d，完成红叶红杆铁皮石斛的快速纯化与扩繁。

步骤（2）中萌发培养基为1/2ms+naa0.1mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（3）中红叶红杆性状诱导培养基为1/2ms+香蕉泥50g/l、蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（4）中扩繁培养基为1/2ms+naa0.1mg/l+6-ba0.5mg/l+ad0.5mg/l+香蕉泥50g/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（5）中生根培养基为1/2ms+naa0.3mg/l+iba0.3mg/l+6-ba0.1mg/l+香蕉泥50g/l+南瓜泥50g/l+蛋白胨1-2g/l+活性炭0.5g/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

成活率100%。

实施例3

（1）带有红叶红杆种质杂交铁皮石斛果实的获得

以带有红叶红杆种质的铁皮石斛为父本或母本，进行以人工授粉方式进行的杂交或自交，授粉后依照铁皮石斛常规栽培技术进行养护培养150d，摘取蒴果备用；

（2）无菌播种

将（1）所述蒴果表面灭菌后播种于无菌萌发培养基，置于26℃，12h/d光周期，3000lx光照强度环境下培养60d；

（3）红叶红杆性状的瓶内诱导

从（2）所述培养产物挑取已分化成苗的2cm植株接种于红叶红杆性状诱导培养基，于置于夜温16℃，日温26℃，16h/d光周期，8000lx光照强度环境培养60d；

（4）红叶红杆铁皮石斛的瓶内切芽快速纯化与扩繁

从（3）所述培养产物中挑取具有明显红叶红杆性状的铁皮石斛植株，切成1cm带芽茎段，于扩繁培养基，置于26℃，16h/d光周期，3000lx光照强度，连续继代培养，继代周期为80d，繁殖系数可达4-6之间；

（5）红叶红杆铁皮石斛的生根培养

当（4）所述种苗累积到所需数量，将所扩繁种苗接种于生根培养基，置于26℃，16h/d光周期，3000lx光照强度培养80d，完成红叶红杆铁皮石斛的快速纯化与扩繁。

步骤（2）中萌发培养基为1/2ms+naa0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（3）中红叶红杆性状诱导培养基为1/2ms+香蕉泥100g/l、蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（4）中扩繁培养基为1/2ms+naa0.1mg/l+6-ba2mg/l+ad1.0mg/l+香蕉泥100g/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

步骤（5）中生根培养基为1/2ms+naa0.3mg/l+iba0.3mg/l+6-ba0.1mg/l+香蕉泥100g/l+南瓜泥100g/l+蛋白胨2g/l+活性炭1g/l+蔗糖20g/l+琼脂5.5g/l，ph5.6。

成活率100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。