本发明涉及利用生物发酵制备杀虫剂的
技术领域：
，特别涉及一种以黄杜鹃为原料发酵制备杀虫剂的方法。
背景技术：
：黄杜鹃是杜鹃花科杜鹃属落叶灌木，高0.5-2m，分枝稀疏，枝条直立，幼时密被灰白色柔毛及疏刚毛。叶纸质，长圆形至长圆状披针形，长5-11cm，宽1.5-3.5cm，先端钝，具短尖头，基部楔形，边缘具睫毛，幼时上面被微柔毛，下面密被灰白色柔毛，沿中脉被黄褐色刚毛，中脉和侧脉凸出，叶柄长2-6mm，被柔毛和少数刚毛，总状伞形花序顶生，花多达13朵，先花后叶或与叶同时开放，花梗长1-2.5cm，被微柔毛及疏刚毛，花萼裂片小，圆齿状，被微柔毛和刚毛状睫毛，花冠阔漏斗形，长4.5cm，直径5-6cm，黄色或金黄色，内有深红色斑点，花冠管向基部渐狭，圆筒状，长2.6cm，外面被微柔毛，裂片5，椭圆形或卵状长圆形，长2.8cm，外面被微柔毛，雄蕊5，不等长，长不超过花冠，花丝扁平，中部以下被微柔毛，子房圆锥状，长4mm，密被灰白色柔毛及疏刚毛，花柱长达6厘米，无毛。蒴果圆锥状长圆形，长2.5-3.5厘米，具5条纵肋，被微柔毛和疏刚毛。黄杜鹃盛产于湖南、广东、广西、四川、贵州和云南一带，易于采集，作为药材可用于治疗关节炎、跌打损伤等，但黄杜鹃中含有棱木毒素与石楠素，其氯仿提取物对多种重要农业害虫具有较强的触杀和拒食活性。因而可用于制备植物性杀虫剂。但传统的植物性杀虫剂多用有机溶剂或煎煮提取，不利于节能也有较大的环境风险，也影响活性物质的稳定性甚至遗失活性物质，而且增加成本使得开发应用困难较大，作用效果缓慢，因此给植物源杀虫剂的研发和生产带来了巨大的经济困难。技术实现要素：本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种对农业害虫具有较好的杀灭作用，生产方式环保无污染节能省力的杀虫剂的制备方法，除此之外，该方法将黄杜鹃酶解后使用植物促生菌发酵，有利活性物质的提取，避免物质失活，利用氯仿萃取提取黄杜鹃中的有效物质，进一步提高该杀虫剂的杀灭性。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种以黄杜鹃为原料发酵制备杀虫剂的方法，包括以下步骤：(1)原料处理：将黄杜鹃洗净，通过水蒸气熏蒸软化后，进行打浆后均质形成黄杜鹃浆液，同时发酵罐清洗干净灭菌备用；(2)酶解：将步骤(1)中所得的黄杜鹃浆液置于发酵罐中，并向其中添加纤维素酶搅拌均匀进行酶解，得到酶解液；(3)发酵：向步骤(2)中的酶解液加入枯草芽孢杆菌液，加压后混合密封发酵，过滤得到发酵液；(4)萃取：将步骤(3)中得到的发酵液转移至萃取罐中，加入氯仿进行萃取，萃取完成后升温蒸馏将氯仿分离，直至不再有物质蒸馏出来，剩下的为萃取液；(5)乳化制粉：向步骤(4)得到的萃取液加入乳化剂，边搅拌边反应6～8h，加入淀粉、分散剂和肥皂水充分混合后进行粉碎筛选，得到杀虫剂粉剂。进一步地，在步骤(1)中，所述水蒸气熏蒸的时间为15～30min，所述发酵罐灭菌为进行121℃的高温杀菌20～30min。进一步地，在步骤(2)中，所述纤维素酶的酶活为18000u/g，所述酶解时间为35～45min。进一步地，所述枯草芽孢杆菌液的添加量为2％，所述枯草芽孢杆菌液中的含菌量为30～50亿/ml。进一步地，在步骤(3)中，所述加压的压力为0.5～1mpa，所述发酵温度为35～45℃，发酵时间为3～4天。进一步地，在步骤(4)中，所述升温蒸馏温度为60～62℃。进一步地，所述乳化剂为羊毛酸、蜂蜡或卵磷脂的一种或多种，乳化剂添加量为所述萃取液的8～15％。进一步地，所述淀粉为玉米淀粉和木薯淀粉以1:1的混合物，淀粉的加入量为180～280份。进一步地，所述分散剂为微晶石蜡，改分散剂的添加量为1～8份，所述筛选的筛网目数为80～100目。本发明通过采用枯草芽孢杆菌作为促生菌发酵黄杜鹃来提取有效活性成分，不仅有利于生物活性物质的提取，且由于发酵过程中无需采用有机溶剂和长时间的高温处理过程，不易造成有效成分活性物质的失活，有利于保证各原料的有效成分的活性。黄杜鹃中含有梫木毒素与石楠素，对多种重要农业害虫具有较强的触杀和拒食活性，梫木毒素与石楠素包含羊踯躅素ⅲ、闹羊花毒素ⅲ、木藜芦毒素ⅲ、日本杜鹃素ⅲ和山月桂萜醇，这些物质可通过氯仿提取。黄杜鹃对农业昆虫有强烈的毒性，主要是由于黄杜鹃中的闹羊花毒素ⅲ、木藜芦毒素和山月桂毒素对马铃薯甲虫和草地贪夜蛾的幼虫具有拒食活性，其中闹羊花毒素ⅲ的效果最显著。当接触昆虫表皮时，会由气孔侵入虫体内而使神经系统发生中毒，若被昆虫吞食，则经由消化系统而发生中毒，以熏蒸剂使用时可通过气孔入侵虫体而达到杀虫的目的。综上所述，由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：(1)本发明中先将黄杜鹃熏蒸软后在进行发酵，有利于黄杜鹃释放芳香类物质，且吸收足够水分易于打浆，再利用枯草芽孢杆菌将黄杜鹃高压发酵，使黄杜鹃中的小分子物质充分释放出来，进一步通过氯仿萃取将黄杜鹃中的梫木毒素与石楠素萃取提出，在蒸馏提纯后制成粉剂杀虫剂，通过萃取提纯可以使害虫致死物质的浓度更高，制成粉剂便于喷洒在农作物上使其接触农业害虫或被昆虫吞食后达到杀灭害虫的目的。(2)本发明中通过蒸汽蒸熟软化和高压发酵提高了黄杜鹃的发酵速率，且在成分上通过添加淀粉、分散剂和肥皂水将黄杜鹃的杀虫活性成分制备成粉剂，在喷洒的时候易于粘附在植物上，且不易被雨水冲刷走，且本发明中使用的原料来源广泛，价格低廉，制备方法简单，经济环保，具有较好的经济效益，可广泛生产。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。实施例1一种以黄杜鹃为原料发酵制备杀虫剂的方法，包括以下步骤：(1)原料处理：将黄杜鹃洗净，通过水蒸气熏蒸软化后，进行打浆后均质形成黄杜鹃浆液，同时发酵罐清洗干净灭菌备用，水蒸气熏蒸的时间为15min，所述发酵罐灭菌为进行121℃的高温杀菌20min。(2)酶解：将步骤(1)中所得的黄杜鹃浆液置于发酵罐中，并向其中添加纤维素酶搅拌均匀进行酶解，得到酶解液，纤维素酶的酶活为18000u/g，所述酶解时间为35min；(3)发酵：向步骤(2)中的酶解液加入枯草芽孢杆菌液，枯草芽孢杆菌液的添加量为2％，所述枯草芽孢杆菌液中的含菌量为30亿/ml，加压后混合密封发酵，加压的压力为0.5mpa，所述发酵温度为35℃，发酵时间为3天，过滤得到发酵液；(4)萃取：将步骤(3)中得到的发酵液转移至萃取罐中，加入氯仿进行萃取，萃取完成后升温蒸馏将氯仿分离，升温蒸馏温度为60℃，直至不再有物质蒸馏出来，剩下的为萃取液；(5)乳化制粉：向步骤(4)得到的萃取液加入乳化剂，边搅拌边反应6～8h，加入淀粉、分散剂和肥皂水充分混合后进行粉碎筛选，得到杀虫剂粉剂，乳化剂为羊毛酸、蜂蜡或卵磷脂的一种或多种，乳化剂添加量为所述萃取液的8％，淀粉为玉米淀粉和木薯淀粉以1:1的混合物，淀粉的加入量为180份，分散剂为微晶石蜡，改分散剂的添加量为1份，所述筛选的筛网目数为80目。实施例2一种以黄杜鹃为原料发酵制备杀虫剂的方法，包括以下步骤：(1)原料处理：将黄杜鹃洗净，通过水蒸气熏蒸软化后，进行打浆后均质形成黄杜鹃浆液，同时发酵罐清洗干净灭菌备用，水蒸气熏蒸的时间为30min，所述发酵罐灭菌为进行121℃的高温杀菌30min。(2)酶解：将步骤(1)中所得的黄杜鹃浆液置于发酵罐中，并向其中添加纤维素酶搅拌均匀进行酶解，得到酶解液，纤维素酶的酶活为18000u/g，所述酶解时间为45min；(3)发酵：向步骤(2)中的酶解液加入枯草芽孢杆菌液，枯草芽孢杆菌液的添加量为2％，所述枯草芽孢杆菌液中的含菌量为50亿/ml，加压后混合密封发酵，加压的压力为1mpa，所述发酵温度为37℃，发酵时间为4天，过滤得到发酵液；(4)萃取：将步骤(3)中得到的发酵液转移至萃取罐中，加入氯仿进行萃取，萃取完成后升温蒸馏将氯仿分离，升温蒸馏温度为62℃，直至不再有物质蒸馏出来，剩下的为萃取液；(5)乳化制粉：向步骤(4)得到的萃取液加入乳化剂，边搅拌边反应6～8h，加入淀粉、分散剂和肥皂水充分混合后进行粉碎筛选，得到杀虫剂粉剂，乳化剂为羊毛酸、蜂蜡或卵磷脂的一种或多种，乳化剂添加量为所述萃取液的15％，淀粉为玉米淀粉和木薯淀粉以1:1的混合物，淀粉的加入量为280份，分散剂为微晶石蜡，改分散剂的添加量为8份，所述筛选的筛网目数为100目。实施例3一种以黄杜鹃为原料发酵制备杀虫剂的方法，包括以下步骤：(1)原料处理：将黄杜鹃洗净，通过水蒸气熏蒸软化后，进行打浆后均质形成黄杜鹃浆液，同时发酵罐清洗干净灭菌备用，水蒸气熏蒸的时间为25min,所述发酵罐灭菌为进行121℃的高温杀菌25min。(2)酶解：将步骤(1)中所得的黄杜鹃浆液置于发酵罐中，并向其中添加纤维素酶搅拌均匀进行酶解，得到酶解液，纤维素酶的酶活为18000u/g，所述酶解时间为40min；(3)发酵：向步骤(2)中的酶解液加入枯草芽孢杆菌液，枯草芽孢杆菌液的添加量为2％，所述枯草芽孢杆菌液中的含菌量为40亿/ml，加压后混合密封发酵，加压的压力为0.8mpa，所述发酵温度为40℃，发酵时间为3～4天，过滤得到发酵液；(4)萃取：将步骤(3)中得到的发酵液转移至萃取罐中，加入氯仿进行萃取，萃取完成后升温蒸馏将氯仿分离，升温蒸馏温度为61℃，直至不再有物质蒸馏出来，剩下的为萃取液；(5)乳化制粉：向步骤(4)得到的萃取液加入乳化剂，边搅拌边反应7h，加入淀粉、分散剂和肥皂水充分混合后进行粉碎筛选，得到杀虫剂粉剂，乳化剂为羊毛酸、蜂蜡或卵磷脂的一种或多种，乳化剂添加量为所述萃取液的8～15％，淀粉为玉米淀粉和木薯淀粉以1:1的混合物，淀粉的加入量为250份，分散剂为微晶石蜡，改分散剂的添加量为5份，所述筛选的筛网目数为90目。实施例4一种以黄杜鹃为原料发酵制备杀虫剂的方法，包括以下步骤：(1)原料处理：将黄杜鹃洗净，通过水蒸气熏蒸软化后，进行打浆后均质形成黄杜鹃浆液，同时发酵罐清洗干净灭菌备用，水蒸气熏蒸的时间为18min,所述发酵罐灭菌为进行121℃的高温杀菌22min。(2)酶解：将步骤(1)中所得的黄杜鹃浆液置于发酵罐中，并向其中添加纤维素酶搅拌均匀进行酶解，得到酶解液，纤维素酶的酶活为18000u/g，所述酶解时间为38min；(3)发酵：向步骤(2)中的酶解液加入枯草芽孢杆菌液，枯草芽孢杆菌液的添加量为2％，所述枯草芽孢杆菌液中的含菌量为35亿/ml，加压后混合密封发酵，加压的压力为0.6mpa，所述发酵温度为42℃，发酵时间为3～4天，过滤得到发酵液；(4)萃取：将步骤(3)中得到的发酵液转移至萃取罐中，加入氯仿进行萃取，萃取完成后升温蒸馏将氯仿分离，升温蒸馏温度为60℃，直至不再有物质蒸馏出来，剩下的为萃取液；(5)乳化制粉：向步骤(4)得到的萃取液加入乳化剂，边搅拌边反应6～8h，加入淀粉、分散剂和肥皂水充分混合后进行粉碎筛选，得到杀虫剂粉剂，乳化剂为羊毛酸、蜂蜡或卵磷脂的一种或多种，乳化剂添加量为所述萃取液的10％，淀粉为玉米淀粉和木薯淀粉以1:1的混合物，淀粉的加入量为200份，分散剂为微晶石蜡，改分散剂的添加量为3份，所述筛选的筛网目数为85目。实施例5一种以黄杜鹃为原料发酵制备杀虫剂的方法，包括以下步骤：(1)原料处理：将黄杜鹃洗净，通过水蒸气熏蒸软化后，进行打浆后均质形成黄杜鹃浆液，同时发酵罐清洗干净灭菌备用，水蒸气熏蒸的时间为25min,所述发酵罐灭菌为进行121℃的高温杀菌25min。(2)酶解：将步骤(1)中所得的黄杜鹃浆液置于发酵罐中，并向其中添加纤维素酶搅拌均匀进行酶解，得到酶解液，纤维素酶的酶活为18000u/g，所述酶解时间为40min；(3)发酵：向步骤(2)中的酶解液加入枯草芽孢杆菌液，枯草芽孢杆菌液的添加量为2％，所述枯草芽孢杆菌液中的含菌量为45亿/ml，加压后混合密封发酵，加压的压力为0.8mpa，所述发酵温度为45℃，发酵时间为4天，过滤得到发酵液；(4)萃取：将步骤(3)中得到的发酵液转移至萃取罐中，加入氯仿进行萃取，萃取完成后升温蒸馏将氯仿分离，升温蒸馏温度为62℃，直至不再有物质蒸馏出来，剩下的为萃取液；(5)乳化制粉：向步骤(4)得到的萃取液加入乳化剂，边搅拌边反应7h，加入淀粉、分散剂和肥皂水充分混合后进行粉碎筛选，得到杀虫剂粉剂，乳化剂为羊毛酸、蜂蜡或卵磷脂的一种或多种，乳化剂添加量为所述萃取液的12％，淀粉为玉米淀粉和木薯淀粉以1:1的混合物，淀粉的加入量为250份，分散剂为微晶石蜡，改分散剂的添加量为6份，所述筛选的筛网目数为90目。实施例6将黄杜鹃洗净后直接进行酶解，不实施步骤(1)，其他实施与实施例3一致。实施例7将黄杜鹃实施步骤(1)后直接进行步骤(3)的发酵，不进行步骤(2)的酶解，其他实施与实施例3一致。实施例8将黄杜鹃实施步骤(1)～步骤(3)后，不进行步骤(4)的其他实施与实施例3一致。实施例9将本发明中实施例1～实施例8中所制备的杀虫剂进行杀虫效果试验。具体试验如下：在田间捉回菜粉蝶、斜纹夜蛾、亚洲玉米螟和小菜蛾个100只，分别置于透明玻璃管中，玻璃罐两端开口使用纱网封口，每个玻璃管中放入5片菜叶，编号1～8，分别翻动菜叶均匀喷洒实施例1～实施例8制备的杀虫剂，并使用纱网将玻璃管口盖住，观察玻璃罐内害虫的死亡情况，并在48h后模拟自然界的吹风下雨进行吹入微风并以200ml/min的流量喷淋自来水10min，统计喷药后72h后的害虫死亡率，每组实验重复三次并求平均值，实验结果如下表所示：由上表可见，本发明中只有完全按照本发明的试验方法实施制备出的杀虫剂杀虫效果好，实施例1～实施例5中完全按照本发明的步骤使用不同是实验参数制备的杀虫剂，杀虫效果都很好，实施例6中没有实施步骤(1)，即没有将黄杜鹃蒸熟打浆，直接进行酶解，不利于黄杜鹃内的活性物质释放，实施例7中没有进行酶解，直接进行发酵也会导致活性物质释放不完全，二实施例8中没有进行萃取，导致制备的杀虫剂中有效成分浓度低，导致杀虫效果大大减弱，所以完全按照本发明中的步骤完全实施制备的杀虫剂用于农作物的害虫防治，具有杀虫效率快的优势。实施例10将实施例1～实施例8中制得的杀虫剂进行进行杀虫的相关成分测试，黄杜鹃的氯仿萃取液中主要包含羊踯躅素ⅲ、闹羊花毒素ⅲ、木藜芦毒素ⅲ、日本杜鹃素ⅲ和山月桂萜醇，其中闹羊花毒素ⅲ为昆虫的主要致死成分，测试并计算实施例1～实施例8中萃取液的提取率及闹羊花毒素ⅲ提取效率，萃取液的提取率为萃取液占原料黄杜鹃的质量比，闹羊花毒素ⅲ则通过高效液相色谱蒸发光散射检测法检测其在萃取液中的含量，其中实施例8的是闹羊花毒素ⅲ在发酵液中的含量，数据如下表所示：萃取液的提取率/％闹羊花毒素ⅲ含量/％实施例11.8311.56实施例21.6512.41实施例31.7510.98实施例41.7612.03实施例51.8111.53实施例61.238.65实施例70.895.49实施例800.56由上表可知，实施例1～实施例5中完全按照本发明中的所有步骤进行实施，提取萃取液含量较多，而且闹羊花毒素ⅲ的含量也多，杀虫剂效果好。综合以上实施例，只有完全通过本发明中所有步骤制备出来的杀虫剂才能利用黄杜鹃制备出高效强力的杀虫剂，本方法科学合理，容易实现，可广泛推广。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12