一种利用根皮酚清除番茄黄化曲叶病毒的方法与流程

本发明属于病虫害防控技术领域，具体涉及一种利用根皮酚清除昆虫介体内番茄黄化曲叶病毒的方法。

二、技术背景

植物病毒病是威胁农作物安全生产的一类重要病害，全世界每年因农作物感染病毒造成的损失就高达200亿美元左右。当前对病毒病的防治仍以预防为主，主要依赖抗病作物和化学防治，生产上尚缺少安全有效的病毒病治疗措施。要有效治疗植物病毒病，对病毒的直接破坏清除最为关键，然而当前有关植物病毒清除的研究报道还较少。许多来源于植物的天然活性物质已被发现具有人类疾病防控的作用，但在植物病毒防控中的作用还没有被充分发掘。根皮酚由根皮苷降解而来，而根皮苷是由根皮素和配糖体为葡糖苷结合成的苷，能抑制一些微生物，国内外的临床研究还表明，根皮苷在治疗糖尿病方面有很好的疗效。根皮酚是否对植物病毒具有降解作用？国内外还未见研究报道。

番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlvirus)属双生病毒科(geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)病毒，是由昆虫介体烟粉虱传播的最重要的植物病毒，其为单链环状dna病毒。近年来，由于烟粉虱的强入侵性导致其在世界各地普遍发生，番茄黄化曲叶病毒病也因此在非洲、美洲、亚洲等地区多个国家流行，在我国已蔓延到江苏、浙江、云南等大多数省市，不仅使番茄大面积减产，而且使其品质下降。除危害番茄外，番茄黄化曲叶病毒还侵染辣椒、烟草和南瓜等其它植物。研究根皮酚对烟粉虱体内番茄黄化曲叶病毒的影响，以期利用根皮酚作为一种植物病毒病治疗剂，在植物病毒病防控中发挥作用。

三、

技术实现要素：

1、发明目的

提供一种理想的植物病毒清除方法，能安全去除烟粉虱体内的番茄黄化曲叶病毒，为植物病毒病的控制提供新方法。

2、技术方案

本发明为一种植物病毒的清除方法，其特征在于利用根皮酚清除烟粉虱体内的番茄黄化曲叶病毒。

3、有益效果

本发明的方法与现有技术相比，产生以下有益效果：(1)与常规的控制昆虫介体数量以控制植物病毒病相比，本发明通过有效去除昆虫介体内植物病毒来控制病毒病，防控思路新且针对性强；(2)与化学药剂防治传毒介体或植物病毒病相比，本发明利用来源于植物的根皮酚进行控制，可切实提高植物病毒病的无公害控制水平，有效减少环境污染。

四、具体实施方式

本发明的实施例是采用室内测定的方法。

测定方法如下：

1、烟粉虱接毒

烟粉虱虫源为长期室内饲养在番茄黄化曲叶病发病番茄植株上，羽化后立即再接至番茄黄化曲叶病发病严重番茄植株上进行再获毒，用套袋将烟粉虱套在发病且无虫叶片上，于室内取食24h后取出。其中部分试虫在取食24h后即放置于-20℃冰箱中，直接用于病毒检测，其余试虫则用于后面的根皮酚处理试验。

2、根皮酚处理烟粉虱

采用营养液饲喂法对烟粉虱进行根皮酚处理。将根皮酚溶解于n’n-二甲基甲酰胺中配成母液，然后再与营养液混合，分别配制含500mg/l和100mg/l两种浓度根皮酚的营养液，用于喂饲烟粉虱，同时以不含根皮酚但含有与500mg/l根皮酚营养液中相同量n’n-二甲基甲酰胺的营养液作对照，共喂饲6天。将100μl营养液加入两头通的玻璃管的一端封口膜夹层中，烟粉虱放于管内，另一端用纱布封口。每管30头，每处理4管。

期间每两天加营养液一次，分别在第1天、第3天和第5天加，每次加100μl。

3、烟粉虱中番茄黄化曲叶病毒的检测

将喂食6天后各管内存活的烟粉虱取出，放入冰箱-20℃内，用于番茄黄化曲叶病毒检测。

单头烟粉虱dna提取：在1.5ml的离心管中加入20μl的dna碱裂解液(50mmol/ltris-hcl(ph8.0)，20mmol/lnacl，1mmol/ledta，1％sds)，用灭菌牙签充分研磨。加1μl蛋白酶k(20mg/ml)，离心30秒，60℃水浴1小时，追加1μl蛋白酶k，离心30s，继续水浴2小时，加178μl的双蒸水，100℃水浴5min，灭活蛋白酶k。取100μl提取液于另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，4℃冰箱沉淀过夜后4℃13000rpm离心10分钟，倒出乙醇，晾干后加20μl的双蒸水溶解dna，-20℃保存。

检测番茄黄化曲叶病毒的特异性引物为：tylcv-f：acgcatgcctctaatccagtgta，tylcv-r：ccaataaggcgtaagcgtgtagac，扩增片段大约为600bp左右。pcr的反应体系为25μl，包含12.5μl2×tsingkemastermix(50mmkcl，20mmtris-hcl，2mmmgcl2，200nmdntps，2u/μltaq酶，上样缓冲液)，0.5μl引物tylcv-f，0.5μl引物tylcv-r，9.5μlddh2o，2μldna模板。pcr参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，循环结束后72℃延伸20min。pcr产物进行电泳，拍照。

实施效果：

研究发现，烟粉虱经根皮酚处理后，其体内植物病毒可被清除。pcr检测携带番茄黄化曲叶病毒的烟粉虱成虫经根皮酚处理前后体内病毒的变化，发现取食含500mg/l根皮酚营养液6d后，烟粉虱体内便检测不到番茄黄化曲叶病毒，而经不含根皮酚营养液饲喂6d后，其体内仍能检测到番茄黄化曲叶病毒，取食含100mg/l根皮酚营养液的烟粉虱，其体内番茄黄化曲叶病毒扩增条带也显著变弱(图1)。

附图说明：

图1根皮酚处理后烟粉虱体内番茄黄化曲叶病毒pcr产物电泳图。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种利用根皮酚清除烟粉虱体内番茄黄化曲叶病毒的方法。针对尚未有清除烟粉虱体内番茄黄化曲叶病毒以提高控病效果的问题，利用根皮酚处理烟粉虱，可明显清除害虫体内番茄黄化曲叶病毒，从而极大降低了烟粉虱传播病毒机会，有利于提高病害控制效果。同生产上传统的番茄黄化曲叶病防控主要利用抗病虫品种、化学或物理手段控制烟粉虱数量、用病毒拮抗剂控制病毒等手段相比，本技术利用根皮酚清除烟粉虱体内植物病毒，从而提高控制病毒效果，控害方式新颖且安全性高，未来将具有一定的应用前景。

技术研发人员：郭慧芳;孙帅;张志春;牛洪涛
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：2018.09.11
技术公布日：2019.01.11