miR-71-5p在害虫防治中的应用的制作方法

本发明属于害虫防治领域，具体涉及mir-71-5p在害虫防治中的应用。

背景技术：

在哺乳类动物，已有报道证明了一系列转录因子参与调控解毒酶与谷胱甘肽代谢途径中酶的表达。其中nf-e2相关因子2(nf-e2-relatedfactor2，nrf2)是报道最多的一个转录因子，它是生物细胞氧化应激反应和抵抗外源有毒物质途径中的关键调控因子。在细胞核中，nrf2可以与一类bzip转录因子(maff,mafg,mafk)异源二聚化后，结合于下游基因的启动子上的调控元件，启动相关抗氧胁迫和解毒酶基因表达，包括谷胱甘肽代谢途径的γ-谷氨酸合成酶、抗氧胁迫途径的过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽硫转移酶(gst)等(kwaketal.,2003；minetal.,2008；chenetal.,2018)。在昆虫中，相关的研究相对较少，并且较多的集中在果蝇抗药性。研究指出nrf2在抗有机氯杀虫剂2,2-双(对氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷(ddt)的果蝇抗性品系中的表达量显著高于敏感品系，通过促进解毒酶的表达而增强昆虫抗药性(misraetal.,2013；wanetal.,2014)。在农业害虫斜纹夜蛾中，证明了nrf2参与昆虫抵抗多种植物次生物质和化学杀虫剂引起的氧胁迫伤害，其中一个机制为启动了解毒酶gst的表达(chenetal.,2018)。

microrna(mirna)是生物中一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码小分子rna，在生物体内参与一系列生长和发育的调控。最早发现的mirna家族成员是lin-4和lin-7。其中lin-4通过转录后调控lin-14基因，从而调控线虫发育时间(leeetal.,1993)。mirna在生物体内的合成受到严格的控制，mirna和编码基因一样，由rnapolymeraseⅱ转录形成长度上千的初级转录本pri-mirna，在drosha酶作用下，pri-mirna被切割形成大小约为70nt的茎环结构：pre-mirna。当pre-mirna从细胞核转运到细胞质时，在dicer酶作用下，被剪切形成22nt左右mirna。mirna主要通过与靶基因结合后，降解mrna或抑制翻译来调节靶基因的表达。mirna和靶基因可以进行完全或不完全互补配对。通常认为，当进行完全互补时，mirna可以启动对mrna的切割，使靶基因表达下调，在这种机制中，mirna的结合位点都在mrna的编码区或者是开放阅读框中。当mirna与mrna不完全互补时，mirna通过抑制靶基因的翻译而抑制表达，这种mirna通常作用位点是在mrna的3’非翻译区(utr)(bartel,2009)。

尽管已有大量mirna的研究报道，但mirna在昆虫与植物关系中的作用报道并不多，并且较多的研究报道为差异表达mirna的分析。khajuria等人分别用抗性和敏感品系的小麦种子喂食麦廮蝇，运用基因芯片技术分析，发现了dme-mir-2944-3p和dme-mir-289等mirna的表达存在显著差异，暗示这些差异表达的mirna可能参与麦廮蝇适应宿主植物(khajuriaetal.,2013)。在哺乳类动物，较多报道证明了植物次生物质治疗癌症中，mirna参与了调控。在人胃癌细胞中，3,3'-二吲哚基甲烷处理通过mir-30e调节细胞自噬atg5基因的表达，进而调节胃癌细胞自噬，达到抑制胃癌细胞增殖的效果(yangetal.,2016)。在哺乳动物抗氧胁迫的研究中，报道了作用于nrf2的mirna(narasimhanetal.,2012；renetal.，2015；narasimhanetal.，2014；yangetal.，2015；wangetal.，2015)。在镰刀型细胞贫血症中，mir-144可以靶向nrf2(sangokoyaetal.,2010)。在大鼠乳腺癌模型中，mir-93可以调控nrf2活性(singhetal.,2013)。在昆虫中还没有作用于nrf2的mirna的研究报道。研究调控nrf2的重要mirna对发展害虫防治新靶标有着重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供昆虫类mir-71-5p在害虫防治中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

目前的研究表明，mir-71-5p在原口动物和后口动物中的棘皮动物、半索动物和头索动物纲中存在，在脊椎动物和尾索动物中则没有mir-71(sgmdeetal.,2013)。mir-71-5p的功能在线虫和昆虫中已经有研究报道。在蝗虫中，mir-71可以靶向几丁质合成酶chs1的ore区，负调控chs1表达，参与调控蝗虫的蜕皮过程(yangetal.,2016)。在线虫中，mir-71参与调控去除生殖细胞引发的寿命延长，超表达mir-71能增加去除生殖细胞的线虫寿命(bouliasetal.,2012)。虽然哺乳动物中已有mirna调控nrf2的报道(仅做调控研究，未做表征研究)，但这些mirna在昆虫中没有同源序列。而昆虫中mirna对nrf2的调控，目前未见有任何的报道。

发明人将5龄一天的斜纹夜蛾喂食其偏好的芥菜，在6h和48h提取中肠的总rna，通过高通量测序分析，发现斜纹夜蛾进食芥菜后大量的解毒酶上调，nrf2作为氧胁迫通路中的一个关键转录因子，在这个过程中也发生上调。同时发明人也进行了smallrna高通量测序分析，从测序所得到的所有mirna中，通过预测分析可能作用于slnrf2的mirna。我们发现mir-71-5p可能作用于slnrf2，因此我们将mir-71-5pmimics(模拟体)注射5龄1天的斜纹夜蛾，并喂食含有芥菜主要的次生物质的培养基，结果发现mir-71-5p能抑制斜纹夜蛾的生长，并且在注射一定时间后出现死亡。这个结果表明mir-71-5p对斜纹夜蛾防治的有效性。由于昆虫类mir-71-5p保守性很强，因此也可用于防治其他害虫。可直接将mir-71-5p用于防治进食植物的害虫，或转基因植物进行害虫防治。

昆虫类mir-71-5p在制备杀虫剂或昆虫抑制剂中的应用。

优选的，所述昆虫为鳞翅目昆虫。

优选的，所述鳞翅目昆虫包括斜纹夜蛾、蚕、茶尺蠖、小菜蛾、草地贪夜蛾、水稻二化螟。

优选的，所述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾。

优选的，所述斜纹夜蛾mir-375-3p的序列如5‘ugaaagacaggaguagugagaug’3(seqidno：1)所示。

一种杀虫剂，所述杀虫剂中包含有昆虫类mir-71-5p。

优选的，所述昆虫为鳞翅目昆虫。

优选的，所述鳞翅目昆虫包括斜纹夜蛾、蚕、茶尺蠖、小菜蛾、草地贪夜蛾、水稻二化螟。

优选的，所述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾。

优选的，所述斜纹夜蛾mir-375-3p的序列如5‘ugaaagacaggaguagugagaug’3(seqidno：1)所示。

一种昆虫抑制剂，所述昆虫抑制剂中包含昆虫类mir-71-5p。

优选的，所述昆虫为鳞翅目昆虫。

优选的，所述鳞翅目昆虫包括斜纹夜蛾、蚕、茶尺蠖、小菜蛾、草地贪夜蛾、水稻二化螟。

优选的，所述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾。

优选的，所述斜纹夜蛾mir-375-3p的序列如5‘ugaaagacaggaguagugagaug’3(seqidno：1)所示。

本发明的有益效果是：

本发明发现斜纹夜蛾类mir-71-5p可有效防治斜纹夜蛾，该序列在别的昆虫内也存在，高度保守，因此也可用于防治其他害虫。

本发明用农业害虫斜纹夜蛾进行实验，证实mir-71-5p影响斜纹夜蛾进食含芥菜次生物质的培养基，其作用机制为抑制slnrf2的表达，进而影响了一系列受nrf2调控的应对植物中次生物质的下游基因。综合上述的实验结果，可直接将mir-71-5p用于防治进食植物的害虫，或转基因植物进行害虫防治。

附图说明

图1为mir-71-5p在不同昆虫中的序列比较；

图2为i3c处理斜纹夜蛾细胞后mir-71-5p(a)和slnrf2(b)的表达谱分析；图中数据为平均值±se，柱上星号表示差异显著(p<0.01；p<0.001)。ck:无i3c添加；

图3为mir-71-5pmimics处理斜纹夜蛾spli-221细胞抑制slnrf2的表达；

图4为mir-71-5pmimics处理斜纹夜蛾幼虫后，体重与进食量的变化；

图5为mir-71-5pmimics处理斜纹夜蛾幼虫后的表型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

1、靶向斜纹夜蛾和nrf2的mirna预测

结合转录组和smallrna测序的结果，并采用targetscan、rna22、rnahybrid和pita等4个网站预测可能靶向slnrf2的mirna，选择4个网站预测结果的交集mirna。结果表明mir-71-5p可能靶向slnrf2的3’末端，mir-71-5p与slnrf2结合的预测自由能为-21.4kcal/mol。图1为mir-71-5p在不同昆虫中的序列比较。其中斜纹夜蛾的mir-71-5p序列为：5‘ugaaagacaggaguagugagaug’3(seqidno：1)。

核对我们的斜纹夜蛾中肠测序数据库，结果见表1。

表1mirna在进食芥菜的斜纹夜蛾中肠的表达

表1结果显示：斜纹夜蛾从培养基转食芥菜6h的中肠mir-71-5p的表达量下调(表1)，表明mir-71-5p可能负调控基因的表达。

2、芥菜次生物质吲哚-3-甲醇(i3c)抑制mir-71-5p的表达

由于测序样品是斜纹夜蛾进食芥菜后的中肠组织，而13c为芥菜中的主要次生物质，nrf2与植物次生物质产生的氧胁迫密切相关，为此，我们用i3c处理斜纹夜蛾，验证测序结果。结果表明了mir-71-5p表达量与i3c成反比，也暗示了mir-71-5p可能作用于slnrf2。

进一步，在细胞株中，验证nrf2和mirna的可能关系。结果见图2。图2为i3c处理斜纹夜蛾细胞后mir-71-5p(a)和slnrf2(b)的表达谱分析；图中数据为平均值±se，柱上星号表示差异显著(p<0.01；p<0.001)。ck:无i3c添加。图2中显示，用i3c处理斜纹夜蛾细胞后，slnrf2含量显著上调，mir-71-5p含量显著下降。因此它mir-71-5p可能是以其自身的降解，而解除了对靶基因的抑制作用，促进了靶基因的表达上调，从而影响斜纹夜蛾应对植物次生物质。

3、micrornamimics处理斜纹夜蛾细胞株使预测靶基因表达发生改变

为了进一步研究slnrf2与mir-71-5p之间调控关系，我们分别超表达mir-71-5pmimic于spli-221细胞株，然后检测slnrf2的表达情况。如图3所示，用0.1、0.5和1μgmir-71-5p的处理有浓度梯度效应，浓度越高，slnrf2的表达受到的抑制越显著(图3)。

4、mir-71-5pmimics(模拟体)处理影响斜纹夜蛾生长

选取大小一致、健康状况一致的五龄第一天斜纹夜蛾幼虫，称量每头虫子的重量，随机分为mir-71-5pmimics(模拟体)处理组和ncmimics对照组。顺血液循环流动方向，用微量注射器从斜纹夜蛾幼虫的侧腹部第一和第二腹足之间，分别注射mir-71-5pmimics和ncmimics，注射量为每头虫2μg，注射后饲喂含有芥菜主要次生物质i3c的培养基。每天记录体重进食以及死亡率。

结果见表2和图4、图5。

表2注射mir-71-5p后进食含i3c培养基的斜纹夜蛾死亡率

图4表明：注射mir-71-5p并进食含i3c培养基120h时，斜纹夜蛾体重和进食量比进食正常培养基的斜纹夜蛾(对照)显著下降。表2和图5结果显示：注射mmir-71-5p后，存活的虫子大部分都生长瘦小(见图5)，并且有部分虫子死亡。

本发明用农业害虫斜纹夜蛾进行实验，证实mir-71-5p影响斜纹夜蛾进食含芥菜次生物质的培养基，其作用机制为抑制slnrf2的表达，进而影响了一系列受nrf2调控的应对植物中次生物质的下游基因。综合上述的实验结果，可直接将mir-71-5p用于防治进食植物的害虫，或转基因植物进行害虫防治。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

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<110>华南师范大学

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