本发明涉及组织培养领域。更具体地说，本发明涉及一种促进猪血木快速繁殖的方法。
背景技术：
：猪血木(euryodendronexcelminumh.t.chang)属于山茶科(theaceae)猪血木属多年生木本植物，为我国特有单型属的珍稀濒危植物，已被列为国家二级保护植物。猪血木在自然状况下以有性繁殖为唯一繁殖方式，但其种子萌发和幼苗生长受环境影响严重，种群自然更新困难。技术实现要素：本发明的目的是提供一种促进猪血木快速繁殖的方法，其以猪血木的种子，采用组织培养的方式可快速获得猪血木幼苗，该方法可有效提高猪血木的增殖系数，达5.1-5.3倍，畸形苗率低至1.8％，幼苗成活率高达92.3％，幼苗平均株高96mm，有效解决了猪血木自然更新困难的问题，为猪血木的保护提供了一种新的路径。为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种促进猪血木快速繁殖的方法，包括以下步骤：a、取成熟的猪血木种子，经处理后，得外植体；b、将所述外植体置于无菌苗培养基中培养，得无菌苗；c、将所述无菌苗切割成小段，转接至丛生芽诱导培养基中培养，得丛生芽；d、将所述丛生芽转接到生根壮苗培养基中培养，得猪血木幼苗；其中，所述生根壮苗培养基包括上层培养基和下层培养基，所述上层培养基为：3/4ms+2.2-2.6mg/l6-ba+1.3-1.8mg/lzt+1.0-1.5mg/l2,4-d+1-5g/l羊角灰粉；所述下层培养基为：1/2ms+2.0-3.0mg/l6-ba+1.0-1.5mg/l2,4-d+1.0-1.5mg/lmet+0.5-1.0mg/l氯化胆碱+15-20g/l羊角灰粉；培养条件为：先于22-26℃，黑暗条件下培养3d，再于22-26℃，光照强度1400-1600lux，光照时间8h/d的条件下培养20d，最后于28-30℃，相对湿度为60-80％，遮光度为30-40％的自然光照条件下培养20d。优选的是，所述的促进猪血木快速繁殖的方法，所述上层培养基的厚度为1-3cm，所述下层培养基的厚度为4-6cm。优选的是，所述的促进猪血木快速繁殖的方法，所述羊角灰粉的制备方法为：将羊角用水洗净、沥干，于550-600℃高温煅烧后，冷却，制得。优选的是，所述的促进猪血木快速繁殖的方法，步骤a中，所述处理具体为：将其置于装有纳米氧化锌水分散液的软包装袋中，浸没、封口，于室温下放置24h后，将所述软包装袋置于超高压容器中，于100-110mpa下处理1-6min，将所述猪血木种子从所述软包装袋中取出，用无菌水冲洗6-8次并用消毒滤纸吸取其表面的水分。优选的是，所述的促进猪血木快速繁殖的方法，所述纳米氧化锌水分散液的质量百分浓度为1-2‰。优选的是，所述的促进猪血木快速繁殖的方法，步骤b中，所述无菌苗培养基具体为：ms+2.0-2.5mg/lzt+1.0-1.5mg/lnaa+0.3-0.5mg/l芸苔素；培养条件为：于培养温度25-28℃，光照强度1800-2000lux，光照时间5-6h/d的条件下培养18d。优选的是，所述的促进猪血木快速繁殖的方法，步骤c中，所述丛生芽诱导培养基具体为：ms+3.5-4.0mg/lzt+1.0-1.5mg/llfmin+1.0-1.5mg/liba+1.0-1.5mg/lnaa+20-30g/l茶花粉提取液；培养条件为：先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再在培养温度22-26℃，光照强度1400-1600lux，光照时间6h/d的条件下培养15d，然后再在培养温度25-28℃，光照强度3400-3600lux，光照时间8h/d的条件下培养15d。优选的是，所述的促进猪血木快速繁殖的方法，所述茶花粉提取液的制备方法为：向水中加入质量分数为6-8％的茶花粉，并将其置于超声波提取器中，于功率460-500w，频率40-45khz，温度30-35℃下提取10-15min，再离心，取上清液，即得。本发明至少包括以下有益效果：第一、通过将生根壮苗培养基设置为由上层培养基和下层培养基组成，可实现生根、壮苗一步完成，节约了培养步骤，上层培养基中，将低浓度的羊角灰粉与6-ba、zt和2,4-d相配合，一方面可促进植株茎叶的生长和伸展，活化根基细胞，诱导生根，另一方面可增强植株细胞对羊角灰粉中矿物活性成分的耐受力，下层培养基中，将高浓度的羊角灰粉与6-ba、2,4-d、met和氯化胆碱相配合，可进一步刺激根基细胞分裂，使根系发达，为植株生长吸取营养，从而促进茎叶的生长，获得健壮的猪血木幼苗；第二、通过将猪血木种子置于装有纳米氧化锌水分散液的软包装袋中，进行超高压处理，纳米氧化锌和超高压结合可显著提高猪血木种子的消毒效果，其一方面可对种子进行彻底的消毒，降低组织培养过程中产生畸形苗的概率，另一方面适应的高压可激活种子中酶的活性，以利于猪血木种子复苏、萌发；第三、通过在丛生芽诱导培养基中添加茶花粉提取液，其富含的氨基酸、维生素、矿物质和活性酶等活性成分，将茶花粉提取液与zt、lfmin、iba和naa配合，可有效促进猪血木细胞的增殖、扩大、分裂和分化，进而显著提高丛生芽的增殖效果；第四、本发明的促进猪血木快速繁殖的方法可有效提高猪血木的增殖系数，达5.1-5.3倍，畸形苗率低至1.8％，幼苗成活率高达92.3％，幼苗平均株高96mm，有效解决了猪血木自然更新困难的问题，为猪血木的保护提供了一种新的路径。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：一种促进猪血木快速繁殖的方法，包括以下步骤：a、取成熟的猪血木种子，将其置于装有纳米氧化锌水分散液的软包装袋中，浸没、封口，于室温下放置24h后，将所述软包装袋置于超高压容器中，于100mpa下处理6min，将所述猪血木种子从所述软包装袋中取出，用无菌水冲洗6次并用消毒滤纸吸取其表面的水分，得外植体；b、将所述外植体置于无菌苗培养基中，于培养温度25-28℃，光照强度1800lux，光照时间5h/d的条件下培养18d，得无菌苗，所述无菌苗培养基具体为：ms+2.0mg/lzt+1.0mg/lnaa+0.3mg/l芸苔素；c、将所述无菌苗切割成2-3mm的小段，转接至丛生芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再在培养温度22-26℃，光照强度1400lux，光照时间6h/d的条件下培养15d，然后再在培养温度25-28℃，光照强度3400lux，光照时间8h/d的条件下培养15d，得丛生芽，所述丛生芽诱导培养基具体为：ms+3.5mg/lzt+1.0mg/llfmin+1.0mg/liba+1.0mg/lnaa+20g/l茶花粉提取液；d、将所述丛生芽转接到生根壮苗培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养3d，再于22-26℃，光照强度1400lux，光照时间8h/d的条件下培养20d，最后于28-30℃，相对湿度为60-80％，遮光度为30-40％的自然光照条件下培养20d，得猪血木幼苗；所述生根壮苗培养基包括上层培养基和下层培养基，所述上层培养基为：3/4ms+2.2mg/l6-ba+1.3mg/lzt+1.0mg/l2,4-d+1g/l羊角灰粉；所述下层培养基为：1/2ms+2.0mg/l6-ba+1.0mg/l2,4-d+1.0mg/lmet+0.5mg/l氯化胆碱+15g/l羊角灰粉；其中，所述上层培养基的厚度为1cm，所述下层培养基的厚度为4cm；所述纳米氧化锌水分散液的质量百分浓度为1‰；所述羊角灰粉的制备方法为：将羊角用水洗净、沥干，于550℃高温煅烧后，冷却，制得；所述茶花粉提取液的制备方法为：向水中加入质量分数为6％的茶花粉，并将其置于超声波提取器中，于功率460w，频率40khz，温度30℃下提取10min，再离心，取上清液，即得。实施例2：一种促进猪血木快速繁殖的方法，包括以下步骤：a、取成熟的猪血木种子，将其置于装有纳米氧化锌水分散液的软包装袋中，浸没、封口，于室温下放置24h后，将所述软包装袋置于超高压容器中，于105mpa下处理3min，将所述猪血木种子从所述软包装袋中取出，用无菌水冲洗7次并用消毒滤纸吸取其表面的水分，得外植体；b、将所述外植体置于无菌苗培养基中，于培养温度25-28℃，光照强度1900lux，光照时间5.5h/d的条件下培养18d，得无菌苗，所述无菌苗培养基具体为：ms+2.2mg/lzt+1.3mg/lnaa+0.4mg/l芸苔素；c、将所述无菌苗切割成2-3mm的小段，转接至丛生芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再在培养温度22-26℃，光照强度1500lux，光照时间6h/d的条件下培养15d，然后再在培养温度25-28℃，光照强度3500lux，光照时间8h/d的条件下培养15d，得丛生芽，所述丛生芽诱导培养基具体为：ms+3.7mg/lzt+1.2mg/llfmin+1.2mg/liba+1.2mg/lnaa+25g/l茶花粉提取液；d、将所述丛生芽转接到生根壮苗培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养3d，再于22-26℃，光照强度1500lux，光照时间8h/d的条件下培养20d，最后于28-30℃，相对湿度为60-80％，遮光度为30-40％的自然光照条件下培养20d，得猪血木幼苗；所述生根壮苗培养基包括上层培养基和下层培养基，所述上层培养基为：3/4ms+2.4mg/l6-ba+1.6mg/lzt+1.2mg/l2,4-d+3g/l羊角灰粉；所述下层培养基为：1/2ms+2.5mg/l6-ba+1.2mg/l2,4-d+1.2mg/lmet+0.8mg/l氯化胆碱+18g/l羊角灰粉；其中，所述上层培养基的厚度为2cm，所述下层培养基的厚度为5cm；所述纳米氧化锌水分散液的质量百分浓度为1.5‰；所述羊角灰粉的制备方法为：将羊角用水洗净、沥干，于575℃高温煅烧后，冷却，制得；所述茶花粉提取液的制备方法为：向水中加入质量分数为7％的茶花粉，并将其置于超声波提取器中，于功率480w，频率42.5khz，温度33℃下提取12min，再离心，取上清液，即得。实施例3：一种促进猪血木快速繁殖的方法，包括以下步骤：a、取成熟的猪血木种子，将其置于装有纳米氧化锌水分散液的软包装袋中，浸没、封口，于室温下放置24h后，将所述软包装袋置于超高压容器中，于110mpa下处理1min，将所述猪血木种子从所述软包装袋中取出，用无菌水冲洗8次并用消毒滤纸吸取其表面的水分，得外植体；b、将所述外植体置于无菌苗培养基中，于培养温度25-28℃，光照强度2000lux，光照时间6h/d的条件下培养18d，得无菌苗，所述无菌苗培养基具体为：ms+2.5mg/lzt+1.5mg/lnaa+0.5mg/l芸苔素；c、将所述无菌苗切割成2-3mm的小段，转接至丛生芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再在培养温度22-26℃，光照强度1600lux，光照时间6h/d的条件下培养15d，然后再在培养温度25-28℃，光照强度3600lux，光照时间8h/d的条件下培养15d，得丛生芽，所述丛生芽诱导培养基具体为：ms+4.0mg/lzt+1.5mg/llfmin+1.5mg/liba+1.5mg/lnaa+30g/l茶花粉提取液；d、将所述丛生芽转接到生根壮苗培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养3d，再于22-26℃，光照强度1600lux，光照时间8h/d的条件下培养20d，最后于28-30℃，相对湿度为60-80％，遮光度为30-40％的自然光照条件下培养20d，得猪血木幼苗；所述生根壮苗培养基包括上层培养基和下层培养基，所述上层培养基为：3/4ms+2.6mg/l6-ba+1.8mg/lzt+1.5mg/l2,4-d+5g/l羊角灰粉；所述下层培养基为：1/2ms+3.0mg/l6-ba+1.5mg/l2,4-d+1.5mg/lmet+1.0mg/l氯化胆碱+20g/l羊角灰粉；其中，所述上层培养基的厚度为3cm，所述下层培养基的厚度为6cm；所述纳米氧化锌水分散液的质量百分浓度为2‰；所述羊角灰粉的制备方法为：将羊角用水洗净、沥干，于600℃高温煅烧后，冷却，制得；所述茶花粉提取液的制备方法为：向水中加入质量分数为8％的茶花粉，并将其置于超声波提取器中，于功率500w，频率45khz，温度35℃下提取15min，再离心，取上清液，即得。对比例1：在实施例2的基础上，步骤a中，取成熟的猪血木种子，将其置于装有纯水溶液的软包装袋中，浸没、封口，其余操作条件同实施例2。对比例2：在实施例2的基础上，步骤a中，将所述软包装袋置于超高压容器中，于90mpa下处理6min，其余操作条件同实施例2。对比例3：在实施例2的基础上，步骤a中，将所述软包装袋置于超高压容器中，于120mpa下处理3min，其余操作条件同实施例2。对比例4：在实施例2的基础上，步骤c中，在所述丛生芽诱导培养基中不添加茶花粉提取液，其余操作条件同实施例2。对比例5：在实施例2的基础上，步骤d中，将所述上层培养基和所述下层培养基混合为均一培养基，其余操作条件同实施例2。对比例6：在实施例2的基础上，步骤d中，在所述上层培养基中不添加羊角灰粉，其余操作条件同实施例2。对比例7：在实施例2的基础上，步骤d中，将所述上层培养基和下层培养基中的羊角灰粉替换为等量的活性炭，其余操作条件同实施例2。统计实施例2和各对比例的增殖系数、畸形苗率、幼苗成活率和平均株高，结果见下表。组别增殖系数(倍)畸形苗率(％)幼苗成活率(％)平均株高(mm)实施例25.31.892.796对比例12.832.170.572对比例23.134.670.874对比例31.960.468.563对比例44.51.990.694对比例55.27.891.488对比例65.010.590.782对比例75.32.092.186实验过中，对比例1和对比例2组培过程中存在细菌污染，可能是在外植体杀菌不彻底导致的；对比例3的畸形苗率最高，可能是超高压处理过度，损害了猪血木种子；对比例5、6、7所得猪血木幼苗的根系均不如实施例2所得猪血木幼苗的根系健壮，且株高显著低于实施例2，说明羊角灰粉的加入方式和加入浓度对猪血木的生根壮苗培养影响显著。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。当前第1页12