本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种三色凤尾蕨组培方法及其在种质保存中的应用。
背景技术：
三色凤尾蕨(pteristricolor)为凤尾蕨科凤尾蕨属植物，其叶柄、裂片边缘呈紫色，羽片中央具白色和玫瑰红色的宽带，从而使叶片整体形成白、红、绿的三色条纹，故此得名。三色凤尾蕨株形优美，叶片色彩斑斓，具有极高的观赏价值，是一种稀有的观赏植物。目前，三色凤尾蕨在国内仅分布于云南南部偏热带的地区，生境狭窄。
凤尾蕨属的很多物种都为观赏植物，被广泛应用于园林园艺、植物造景等，该属的很多物种已经有了孢子无菌萌发、绿色小球(ggb)诱导和植株再生等方面的报道，如白玉凤尾蕨、银中斑凤尾蕨和大叶凤尾蕨等，但三色凤尾蕨的组织培养与快速繁殖鲜有报道或方案不明确，至今市场上也未见该种商品的大量出售。目前的零星市售植株主要来源于野生个体，导致这一稀有物种更加珍稀。为缓解人们对三色凤尾蕨日益增长的审美需求与野生资源日渐枯竭的矛盾，对其开展组培快繁并结合种质资源保存的工作已迫在眉睫。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种三色凤尾蕨组培方法及其在种质保存中的应用，两个月内增殖系数高达1：10以上，满足工厂化育苗的要求，同时离体保存继代周期达1.5年以上，实现该珍稀物种的离体保存。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种三色凤尾蕨的组培方法，以孢子为外植体，包括以下步骤：
1)将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；所述萌发培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：0～0.5mg/l的naa，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，所述萌发培养基的ph值为5.5～6.5；
2)将步骤1)所述萌发苗接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，得绿色小球；所述诱导增殖培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.4mg/l的kt，0.6～1.5mg/l的2,4-d，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，所述诱导增殖培养基的ph值为5.5～6.5；
3)将步骤2)所述绿色小球接种于分化生根培养基进行分化生根培养，得生根组培苗；所述分化生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.6～1.5mg/l的iba，0.06～0.15mg/l的iaa，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，ph值为5.5～6.5。
优选的，步骤1)所述接种前，还包括将孢子置于无菌水中浸泡4～8h后消毒。
优选的，所述消毒包括：将浸泡后的孢子用体积分数为75％的乙醇溶液消毒5～7s，用无菌水冲洗2～5遍，用质量浓度为0.1％的hgcl2溶液消毒5～10min，用无菌水水洗3～8遍。
优选的，步骤1)所述萌发培养，步骤2)所述诱导增殖培养以及步骤3)所述分化生根培养的温度独立的为23±2℃，光照强度独立的为10～20μmol/(m2·s)，光照时间独立的为10～14h/d。
优选的，步骤2)所述接种前，还包括将所述萌发苗分解为根、叶柄、叶片和茎尖组织。
优选的，步骤3)得所述生根组培苗后，还包括炼苗和移栽。
优选的，所述炼苗的时间为3～4d。
优选的，所述移栽的基质包括：腐殖土和沙土，所述腐殖土和沙土的体积比为(1.5～2.6)：1。
本发明还提供了上述组培方法在保存三色凤尾蕨种质资源中的应用，将步骤2)得到的所述绿色小球接种于离体保存培养基进行离体保存，所述离体保存培养基中包括：1～5g/l的花宝1号，0.16～0.25mg/l的ba，0.16～0.25mg/l的naa，1～2g/l的活性炭，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，ph值为5.5～6.5。
优选的，所述离体保存的温度为23±2℃，光照强度为10～20μmol/(m2·s)，光照时间为10～14h/d。
本发明提供了一种三色凤尾蕨组培方法，以孢子为外植体，通过孢子无菌萌发，绿色小球(ggb)诱导增殖、ggb分化、生根及离体保存等步骤，建立了三色凤尾蕨的组培快繁体系，两个月内增殖系数高达1：10以上，满足工厂化育苗的要求。
本发明还提供了上述组培快繁方法在保存三色凤尾蕨种质资源中的应用，将利用组培快繁方法得到的ggb用于离体保存，继代周期达1.5年以上，可实现该珍稀物种的离体保存。
具体实施方式
本发明提供了一种三色凤尾蕨组培方法，以孢子为外植体，包括以下步骤：
1)将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；所述萌发培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：0～0.5mg/l的naa，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，所述萌发培养基的ph值为5.5～6.5；
2)将步骤1)所述萌发苗接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，得绿色小球；所述诱导增殖培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.4mg/l的kt，0.6～1.5mg/l的2,4-d，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，所述诱导增殖培养基的ph值为5.5～6.5；
3)将步骤2)所述绿色小球接种于分化生根培养基进行分化生根培养，得生根组培苗；所述分化生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.6～1.5mg/l的iba，0.06～0.15mg/l的iaa，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，ph值为5.5～6.5。
本发明所述三色凤尾蕨组培快繁方法，以孢子为外植体，将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；所述萌发培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：0～0.5mg/l的naa，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，所述萌发培养基的ph值为5.5～6.5。本发明在所述接种前，优选还包括将孢子置于无菌水中浸泡4～8h后消毒。本发明所述浸泡的时间优选为5～7h，更优选为6h。本发明所述消毒优选包括第一消毒和第二消毒，所述第一消毒优选为将浸泡后的孢子用体积分数为75％的乙醇溶液消毒5～7s，用无菌水冲洗2～5遍；所述第二消毒优选为用质量浓度为0.1％的hgcl2溶液消毒5～10min，用无菌水水洗3～8遍。本发明对所述孢子的来源没有特殊限定，优选来源于成年三色凤尾蕨植株有成熟孢子的叶片，在本发明实施例中，所述孢子的获得方法，包括：在野外选择生长发育良好、没有病虫害的成年三色凤尾蕨植株，剪下长有成熟孢子的叶片，用普通信封装好带回实验室，通过自然脱落并挑选获得不含杂质的孢子。本发明所述第一消毒中，所述无菌水冲洗的次数优选为3遍。本发明所述第二消毒中，所述无菌水冲洗的次数优选为4～6遍，更优选为5遍。
本发明所述萌发培养基包括萌发培养基s1和萌发培养基s2，所述萌发培养基s1中不包含naa；所述萌发培养基s2中包括naa，所述naa在所述萌发培养基s2中的浓度为0.5mg/l。在本发明中，接种后约15天，在萌发培养基s1中最先观察到孢子萌发，约在50天左右萌发培养基s2中最早出现孢子体小苗。本发明优选将得到的萌发的孢子接种于萌发培养基s2进行继代1～2次，获得健壮的小苗备用。本发明对所述naa的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可，细胞生长素naa可促进孢子体发育长大。
本发明所述萌发培养基包括蔗糖，所述蔗糖在所述萌发培养基中的浓度优选为16～24g/l，更优选为18～22g/l，最优选为20g/l。本发明对所述蔗糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述萌发培养基包括琼脂，所述琼脂在所述萌发培养基中的浓度优选为5.2～6g/l，更优选为5.5～5.8g/l，最优选为5.6g/l。本发明对所述琼脂的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述萌发培养基的ph值优选为5.6～6.4，更优选为5.7～6，最优选为5.8。
本发明所述萌发培养的温度优选为23±2℃。本发明所述萌发培养的光照强度优选为10～20μmol/(m2·s)。本发明所述萌发培养的光照时间优选为10～14h/d，更优选为11～13h/d，最优选为12h/d。
得萌发苗后，本发明将所述萌发苗接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，得绿色小球；所述诱导增殖培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.4mg/l的kt，0.6～1.5mg/l的2,4-d，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，所述诱导增殖培养基的ph值为5.5～6.5。本发明在所述接种前，优选还包括将所述萌发苗分解为根、叶柄、叶片和茎尖组织。本发明优选将所述分解得到的各组织接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，所述诱导增殖培养基中包括kt，所述kt在所述诱导增殖培养基中的浓度优选为1.6～2.3mg/l，更优选为1.8～2.1mg/l，最优选为2mg/l。
本发明所述诱导增殖培养基中包括2,4-d，所述2,4-d在所述诱导增殖培养基中的浓度优选为0.7～1.4mg/l，更优选为0.9～1.2mg/l，最优选为1mg/l。在本发明中，细胞生长素2,4-d可促进细胞生长，在较高浓度条件下，可以促使外植体产生ggb；细胞分裂素kt可促进细胞分裂，单独使用kt时不能诱导出ggb；将2,4-d中与kt按照本发明所述比例混合后，可诱导出大量ggb，效果优于单独使用2,4-d。
本发明所述诱导增殖培养基包括蔗糖，所述蔗糖在所述诱导增殖培养基中的浓度优选为16～24g/l，更优选为18～22g/l，最优选为20g/l。本发明对所述蔗糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述诱导增殖培养基包括琼脂，所述琼脂在所述诱导增殖培养基中的浓度优选为5.2～6g/l，更优选为5.5～5.8g/l，最优选为5.6g/l。本发明对所述琼脂的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述诱导增殖培养基的ph值优选为5.6～6.4，更优选为5.7～6，最优选为5.8。
本发明所述诱导增殖培养的温度优选为23±2℃。本发明所述诱导增殖培养的光照强度优选为10～20μmol/(m2·s)。本发明所述诱导增殖培养的光照时间优选为10～14h/d，更优选为11～13h/d，最优选为12h/d。在本发明实施例中，将所述分解后得到的组织，分别接种于诱导增殖培养基上，于上述培养条件下，25天后茎尖组织最先出现绿色突起，在ggb的出现时间和增殖速度上远优于其他组织。将通过茎尖组织得到的ggb继续在此培养条件下继代培养2～3次，每21天继代一次，绿色突起进一步长大直至形成大量ggb，增殖率可达1∶10。
得绿色小球后，本发明将所述绿色小球接种于分化生根培养基进行分化生根培养，得生根组培苗；所述分化生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.6～1.5mg/l的iba，0.06～0.15mg/l的iaa，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，所述分化生根培养基的ph值为5.5～6.5。本发明所述分化生根培养基中包括iba，所述iba在所述分化生根培养基中的浓度优选为0.7～1.4mg/l，更优选为0.9～1.2mg/l，最优选为1mg/l。
本发明所述分化生根培养基中包括iaa，所述iaa在所述分化生根培养基中的浓度优选为0.08～0.13mg/l，更优选为0.09～0.11mg/l，最优选为0.1mg/l。在本发明中，细胞生长素iba和细胞生长素iaa均可促进根的分化，联合使用的效果优于单独使用。
本发明所述分化生根培养基包括蔗糖，所述蔗糖在所述分化生根培养基中的浓度优选为16～24g/l，更优选为18～22g/l，最优选为20g/l。本发明对所述蔗糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述分化生根培养基包括琼脂，所述琼脂在所述分化生根培养基中的浓度优选为5.2～6g/l，更优选为5.5～5.8g/l，最优选为5.6g/l。本发明对所述琼脂的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述分化生根培养基的ph值优选为5.6～6.4，更优选为5.7～6，最优选为5.8。
本发明所述分化生根培养的温度优选为23±2℃。本发明所述分化生根培养的光照强度优选为10～20μmol/(m2·s)。本发明所述分化生根培养的光照时间优选为10～14h/d，更优选为11～13h/d，最优选为12h/d。在本发明中，将获得的ggb转接至所述分化生根培养基中，30天左右开始出现孢子体和根的分化，得到大量生根的三色凤尾蕨小苗。在此培养基中可一步实现三色凤尾蕨的ggb分化生根。
本发明在得所述生根组培苗后，优选还包括炼苗和移栽。具体的，本发明所述炼苗和移栽包括：将瓶苗半开盖放在大棚内炼苗3～4天，然后从培养瓶中取出生根苗，洗去附着的培养基，略微晾干水分后进行移栽。本发明所述移栽的基质优选包括：腐殖土和沙土，所述腐殖土和沙土的体积比优选为(1.5～2.6)：1，更优选为(1.8～2.4)：1，最优选为2:1。本发明在所述移栽前，优选还包括对所述基质进行消毒，所述消毒优选为利用质量浓度为5％甲醛水溶液进行消毒。本发明在所述移栽完成后浇透定根水，水肥管理情况根据本领域常规技术手段即可，前期视小苗生长状况进行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理。
本发明还提供了上述组培快繁方法在保存三色凤尾蕨种质资源中的应用，将步骤2)得到的所述绿色小球接种于离体保存培养基进行离体保存，所述离体保存培养基中包括：1～5g/l的花宝1号，0.16～0.25mg/l的ba，0.16～0.25mg/l的naa，1～2g/l的活性炭，15～25g/l的蔗糖和5～6.2g/l的琼脂，所述离体保存培养基的ph值为5.5～6.5。本发明所述离体保存培养基中包括花宝1号，所述花宝1号在所述立体保存培养基中的浓度优选为2～4g/l，更优选为3g/l。本发明对所述花宝1号的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述离体保存培养基中包括ba，所述ba在所述离体保存培养基中的浓度优选为0.17～0.24mg/l，更优选为0.19～0.22mg/l，最优选为0.2mg/l。本发明对所述ba的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述离体保存培养基中包括naa，所述naa在所述离体保存培养基中的浓度优选为0.17～0.24mg/l，更优选为0.19～0.22mg/l，最优选为0.2mg/l。本发明对所述naa的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。在本发明中，ba和naa同时用于离体保存，一方面可以促进ggb的增多，另一方面可以维持ggb处于绿色小球状态，不会大量分化成小苗，利于保存。
本发明所述离体保存培养基中包括活性炭，所述活性炭在所述离体保存培养基中的浓度优选为1.2～1.8mg/l，更优选为1.4～1.8mg/l，最优选为1.5mg/l。本发明对所述活性炭的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。本发明所述活性炭可吸附ggb增殖过程中分泌的不利物质。
本发明所述离体保存培养基包括蔗糖，所述蔗糖在所述离体保存培养基中的浓度优选为16～24g/l，更优选为18～22g/l，最优选为20g/l。本发明对所述蔗糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述离体保存培养基包括琼脂，所述琼脂在所述离体保存培养基中的浓度优选为5.2～6g/l，更优选为5.5～5.8g/l，最优选为5.6g/l。本发明对所述琼脂的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述立体保存培养基的ph值优选为5.6～6.4，更优选为5.7～6，最优选为5.8。
本发明所述离体保存的温度优选为23±2℃。本发明所述离体保存的光照强度优选为10～20μmol/(m2·s)。本发明所述离体保存的光照时间优选为10～14h/d，更优选为11～13h/d，最优选为12h/d。本发明在进行所述离体保存时，优选每瓶接种5块绿色小球(大小约0.5cm×0.5cm)，绿色小球会增大增多，偶尔会分化出带一片小叶的孢子体。在此培养条件下，继代周期可延长至1.5年以上，大大延长了继代周期，缩短了继代次数，维持了种质资源的遗传性。
下面结合实施例对本发明提供的一种三色凤尾蕨组培快繁方法及其在种质资源的保存中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
于2015年10月份在野外选择生长发育良好，没有病虫害的成年三色凤尾蕨植株，剪下长有成熟孢子的叶片，通过自然脱落并挑选获得不含杂质的孢子。将孢子用双层擦镜纸包好，放入无菌水中浸泡6小时；然后用75％酒精消毒6s，再用无菌水冲洗3遍，用0.1％hgcl2水溶液进行消毒6min，在无菌条件下用无菌水反复水洗5遍。然后用镊子夹起擦镜纸包，再用剪刀剪开擦镜纸包，通过拖带擦镜纸将孢子散落到萌发培养基s1(1/2ms+蔗糖20g/l+琼脂5.6g/l，ph值5.8)中。接种后15天先观察到孢子萌发，将萌发的孢子转接到萌发培养基s2(1/2ms+naa0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5.6g/l，ph值5.8)中，继代2次，获得健壮的小苗备用。
将小苗的茎尖组织接种至诱导增殖培养基(ms+kt2.0mg/l+2，4-d1.0mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5.6g/l，ph值5.8)上，每瓶接种5块组织。25天后茎尖组织出现绿色突起，继续继代培养3次，绿色突起进一步长大直至形成大量绿色小球(ggb)，增殖率可达1∶10。
将获得的ggb转接至分化生根培养基(1/2ms+iba0.1mg/l+iaa0.1mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5.6g/l，ph值5.8)中，30天后开始出现孢子体和根的分化，得到大量生根的三色凤尾蕨小苗，生根率90％以上。
将分化生根培养基中的带根小苗进行移栽。首先将瓶苗半开盖放在大棚内炼苗3～4天，然后从培养瓶中取出生根苗，洗去附着的培养基，略微晾干水分后进行移栽。移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐殖土∶沙土＝2∶1，栽好后浇透定根水，前期视小苗生长状况进行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理，移栽成苗率80％以上。
实施例2
于2015年10月份在野外选择生长发育良好，没有病虫害的成年三色凤尾蕨植株，剪下长有成熟孢子的叶片，通过自然脱落并挑选获得不含杂质的孢子。将孢子用双层擦镜纸包好，放入无菌水中浸泡6小时；然后用75％酒精消毒6s，再用无菌水冲洗3遍，用0.1％hgcl2水溶液进行消毒8min，在无菌条件下用无菌水反复水洗5遍。然后用镊子夹起擦镜纸包，再用剪刀剪开擦镜纸包，通过拖带擦镜纸将孢子散落到萌发培养基s1(1/2ms+蔗糖20g/l+琼脂5.6g/l，ph值5.8)中。接种后15天先观察到孢子萌发，将萌发的孢子转接到萌发培养基s2(1/2ms+naa0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5.6g/l，ph值5.8)中，继代2次，每21天继代一次，获得健壮的小苗备用。
将小苗的茎尖组织接种至诱导增殖培养基(ms+kt2.0mg/l+2，4-d1.0mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5.6g/l，ph值5.8)上，每瓶接种5块组织。25天后茎尖组织出现绿色突起，继续继代培养3次，绿色突起进一步长大直至形成大量绿色小球(ggb)，增殖率可达1∶10。
将ggb转接在离体保存培养基(花宝1号3g/l+ba0.2mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖20g/l+活性炭1.5g/l+琼脂5.6g/l，ph值5.8)上，每瓶接种5块绿色小球(大小约0.5cm×0.5cm)。绿色小球会增大增多，偶尔会分化出带一片小叶的孢子体。在培养温度均为23±2℃，光照强度10～20μmol/(m2·s)，光照12h/d的培养条件下，继代周期可延长至1.5年以上，大大延长了继代周期，缩短了继代次数，维持了种质资源的遗传性。
以实施例1和实施例2得到的健壮小苗为材料，分别在诱导增殖培养基中添加不同浓度的kt和2,4-d，测试其诱导系数，其余条件均与实施例1和实施例2相同，以yd代表各处理，结果如表1所示：
表1激素kt与2,4-d对ggb诱导的影响
注：平均值后的小写字母代表p＝0.05的显著性分析结果
大写字母代表p＝0.01的极显著分析结果
根据上述实验可知，将2,4-d中与kt按照本发明所述比例混合后，可诱导出大量ggb，效果优于单独使用2,4-d，产生了协同作用。
本发明提供了一种三色凤尾蕨组培快繁方法及其在种质资源的保存中的应用，以孢子为外植体，经过160d左右可得到生根的三色凤尾蕨组培快繁苗；利用本发明所述方法，增殖率达1:10，生根率为90％以上，移栽成苗率80％以上；且将增殖得到的ggb进行离体保存，继代周期可延长至1.5年以上，大大延长了继代周期，缩短了继代次数，维持了种质资源的遗传性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。