一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法与流程

本发明涉及免疫细胞冻存技术领域，更具体地，涉及一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法。

背景技术：

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减缓细胞代谢，以达到长期储存的一种技术。其原理是将细胞置于-196℃液氮中超低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将细胞特性保存起来，在需要的时候通过复苏细胞即可使用。细胞冻存时向细胞悬液中加入保护剂，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结的条件下，细胞内水分渗透出细胞外，减少细胞内冰晶形成，从而避免细胞在冰冻过程中的损伤。

细胞免疫治疗是一种具有显著疗效的全新的抗肿瘤的方法，相对于传统的手术、放疗、化疗有很大的优势，已被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗最有前途最有效果的一种治疗手段，是世界上最有希望完全消除肿瘤细胞的治疗手段。常用的免疫细胞种类包括nk细胞、cik细胞、dc-cik细胞、til细胞、lak细胞、capri细胞等，这些细胞都是经过诱导和扩增培养得到的，其初始细胞基本都是外周血或脐带血单个核细胞。然而，人体中的免疫细胞会随着年龄的增长而活性降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞对于未来肿瘤相关疾病的治疗起保障作用；随着时代的发展，人们的生活节奏加快，加上免疫细胞诱导扩增培养需要时间，并且随着免疫细胞治疗项目的推广，免疫细胞的远程运输、长期保存问题就起关键作用，也是细胞制备过程中要面临的问题，所以免疫细胞冻存技术是迫在解决的关键技术。

目前，细胞冻存主要是采取-196℃液氮超低温条件下保存，细胞在超低温条件下，代谢功能停滞，细胞可长时间保存，当需要用细胞时，取出冻存的细胞在37℃水浴中快速解冻，即可恢复细胞的活性及功能。但是现有的免疫细胞冻存方法中，只解决了干细胞和肿瘤细胞的冻存，而免疫细胞冻存方法还未能很好地解决。由于免疫细胞的细胞结构和细胞特性，用以往的细胞冻存液及冻存方法冻存免疫细胞时，免疫细胞易受到冰晶损伤，复苏后细胞活率低，细胞增殖数量不足，细胞易老化，效率低下，冻存质量不高、细胞复苏后活性差以及成活率不高等问题。

技术实现要素：

为了克服现有技术中免疫细胞冻存方法存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存液及用该冻存液冻存免疫细胞的方法，该免疫细胞冻存液能有效地保护免疫细胞，避免免疫细胞在冻存的过程中受到损伤，提高免疫细胞复苏后成活率，并保证免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，延长免疫细胞的存活期，减少免疫细胞表面抗原的丢失。

本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存冻及免疫细胞冻存方法，有效解决免疫细胞长期存储、长时间运输、使用灵活性等。

本发明的目的通过下述的方案实现：一种免疫细胞冻存液，其特征在于，由a冻存液和b冻存液独立的两种冻存液组成，使用时按任意比例混合使用，最优为1:1(v/v)。使用时，先用a冻存液重悬免疫细胞，再加入等体积的b冻存液，混合均匀即可。

进一步地，a冻存液含有人血白蛋白、细胞稳定剂、无血清完全培养基，b冻存液中含有dmso和无血清完全培养基。

进一步地，所述的a冻存液是含有人血白蛋白和细胞稳定剂的无血清完全培养基，其中人血白蛋白和细胞稳定剂的主要作用是：运输及解毒、营养供给、防止成团、维持渗透压；利用a冻存液重悬免疫细胞，使免疫细胞达到一个稳定的状态，防止免疫细胞成团，更有利于细胞在冻存过程中的均匀受冷，进一步地，可以维持免疫细胞的渗透压，使免疫细胞在加入含有医用dmso的b冻存液的过程中保护免疫细胞；复苏的过程中，人血白蛋白和细胞稳定剂主要起冷冻复苏过程中调节渗透压，对细胞保护作用好，可以把医用dmso对细胞的毒性作用降到最低。

所述的b冻存液是含有医用dmso的无血清完全培养基，其中的医用dmso能提高细胞膜对水的通透性，降低溶液和免疫细胞内溶液的冰点，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

进一步地，所述的a冻存液的组分如下：

人血白蛋白10~20ml

细胞稳定剂2~10ml

无血清完全培养基70~90ml

所述的b冻存液的组分如下：

医用dmso5~20ml

无血清完全培养基80~95ml

进一步地，所述无血清完全培养基包括corning无血清培养基kbm581的悬浮细胞培养基或rpmi1640无血清培养基的悬浮细胞培养基。

所述的一种免疫细胞冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

用所述a冻存液重悬免疫细胞，调整密度至2.0×10⁸~4.0×10⁸/ml，吹打均匀后，放置于4℃冰箱。

进一步地，所述用所述a冻存液重悬免疫细胞，调整密度至2.0×10⁸~4.0×10⁸/ml，吹打均匀后，放置于4℃冰箱的步骤之后，还包括以下步骤：待所述a冻存液重悬的免疫细胞温度降至4℃后，取出，加入与所述a冻存液体积相等的所述b冻存液，吹打均匀，分装于冻存容器中，将所述冻存容器转入超低温冰箱存放24h，再转入液氮中冻存，获得冻存免疫细胞。

进一步地，所述b冻存液使用时的温度为0~4℃。

进一步地，所述分装是将吹打均匀后的免疫细胞悬液按量分装于冻存容器中，所述冻存容器为冻存管或冻存袋中。

进一步地，所用的冻存管规格为2ml和5ml，所用的冻存袋规格为50ml。

进一步地，转入超低温冰箱存放前，所述的冻存管放于程序降温盒中，冻存袋放于冻存盒中。

进一步地，所述待所述a冻存液重悬的免疫细胞温度降至4℃后，取出，加入与所述a冻存液体积相等的所述b冻存液，吹打均匀，分装，转入超低温冰箱存放24h，再转入液氮中冻存的步骤之后，还包括以下步骤：冻存免疫细胞复苏，取出冻存免疫细胞，快速地放入水浴中复温，待免疫细胞悬液完全溶解后取出细胞悬液，转入已装有生理盐水的离心管中，离心，洗涤。

进一步地，水浴的温度为37℃~40℃。

进一步地，免疫细胞完全溶解是指细胞悬液冰块溶解完全，且细胞悬液的温度小于10℃。

进一步地，所述生理盐水含有1%(v/v)人血白蛋白。

本发明免疫细胞冻存液中不含有动物血清，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。

本发明免疫细胞冻存液配方简单，各个成分有各自的功能，并且相互配合、协同作用，可以明显提高免疫细胞冻存效果，保证细胞在接近冰点时细胞内水分不会结晶，保证复苏后细胞的活性和细胞增殖能力不受影响。

附图说明

图1为免疫细胞外周血pbmc、脐带血pbmc、cik、nk细胞冻存前与复苏后的活率对比柱状图；

图2为脐带血pmbc冻存前和复苏后cik免疫细胞扩增曲线对比图；

图3为脐带血pmbc冻存前和复苏后nk免疫细胞扩增曲线对比图；

图4为脐带血pmbc冻存前cik免疫细胞培养cd3+cd56+细胞流式细胞仪检测结果；

图5为脐带血pmbc冻存，复苏后cik免疫细胞培养cd3+cd56+细胞流式细胞仪检测结果；

图6为cik免疫细胞冻存、复苏后cd3+cd56+细胞流式细胞仪检测结果；

图7为脐带血pmbc冻存前nk免疫细胞培养cd3-cd16+cd56+细胞流式细胞仪检测结果；

图8为脐带血pmbc冻存，复苏后nk免疫细胞培养cd3-cd16+cd56+细胞流式细胞仪检测结果。

图9为nk免疫细胞冻存、复苏后cd3-cd16+cd56+细胞流式细胞仪检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1:

外周血单个核细胞pbmc冻存复苏：

一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，具体步骤如下：

制备免疫细胞冻存液，包括a冻存液和b冻存液，其组分分别如下：

a冻存液：

人血白蛋白10ml

细胞稳定剂3ml

kbm581无血清培养基87ml

按上述组分配制a冻存液，放置于4℃冰箱保存，备用；

b冻存液：

医用dmso20ml

kbm581无血清培养基80ml

按上述组分配制b冻存液，放置于4℃冰箱保存，备用；

利用上述制备好的免疫冻存液细胞冻存外周血单个核细胞pbmc：

1、取人体外周血，利用淋巴分离液梯度分离得到单个核细胞，用生理盐水重悬，洗涤两遍后，取小样计数及测活率，分出1亿数量的单个核细胞；

2、从冰箱中取出a冻存液，吸取1ml，加入到分出来的1亿单个核细胞中，重悬，轻轻吹打均匀，封口后，再次放入４℃冰箱中，放置10min；

3、从冰箱中取出a冻存液重悬且降温后的免疫细胞，缓慢加入1ml的b冻存液，边加边轻轻搅拌；吹打均匀后，分装于两支2ml的冻存管中，1ml/支；

4、将冻存管封口后，放入程序降温盒中，转入-80℃超低温冰箱，24小时后，转存于液氮中，冻存。

5、液氮中保存1个月后，取出冻存免疫细胞，在40℃水水浴中快速复温，用pbs缓冲溶液洗涤两遍，取小样计数，测活率。

实施例２：

脐带血单个核细胞pbmc冻存复苏及培养cik和nk

一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，具体步骤如下：

制备免疫细胞冻存液，包括a冻存液和b冻存液，其组分分别如下：

a冻存液：

人血白蛋白14ml

细胞稳定剂6ml

kbm581无血清培养基80ml

按上述组分配制a冻存液，放置于4℃冰箱保存，备用；

b冻存液：

医用dmso16ml

kbm581无血清培养基84ml

按上述组分配制b冻存液，放置于4℃冰箱保存，备用；

利用上述制备好的免疫冻存液冻存脐带血单个核细胞pbmc：

1、采集产妇脐带血，利用淋巴分离液梯度分离得到单个核细胞，用生理盐水重悬，洗涤两遍后，取小样计数及测活率，分出1份2亿和2份0.5亿数量的单个核细胞，备用；

2、将分出的2份0.5亿数量的单个核细胞分别按照脐带血cik的培养方法进行cik免疫细胞扩增培养和脐带血nk的培养方法进行nk免疫细胞扩增培养；分别按照脐带血cik试剂盒和脐带血nk试剂盒分别进行操作、补液、计数，收集细胞，测活率，并对细胞进行流式检测；

3、从冰箱中取出a冻存液，吸取1ml，加入到分出来的2亿单个核细胞中，重悬，轻轻吹打均匀，封口后，再次放过４℃冰箱中，放置10min；

4、从冰箱中取出a冻存液重悬且降温后的免疫细胞，缓慢加入1ml的b冻存液，边加边轻轻搅拌；吹打均匀后，分装于两支2ml的冻存管中，1ml/支；

5、将冻存管封口后，放入程序降温盒中，转入-80℃超低温冰箱，24小时后，转存于液氮中，冻存。

6、液氮中保存1个月后，取出冻存免疫细胞，在40℃水水浴中快速复温，用pbs缓冲溶液洗涤两遍，取小样计数，测活率，分出2份0.5亿复苏后的脐带血单个核细胞分别进行cik免疫细胞扩增培养和nk免疫细胞扩增培养，分别按脐带血cik试剂盒和脐带血nk试剂盒进行操作、补液、计数，收集细胞，测活率，并对细胞进行流式检测。

实施例3：

免疫细胞cik冻存复苏

一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，具体步骤如下：

制备免疫细胞冻存液，包括a冻存液和b冻存液，其组分分别如下：

a冻存液：

人血白蛋白20ml

细胞稳定剂10ml

kbm581无血清培养基70ml

按上述组分配制a冻存液，放置于4℃冰箱保存，备用；

b冻存液：

医用dmso10ml

kbm581无血清培养基90ml

按上述组分配制b冻存液，放置于4℃冰箱保存，备用；

将实施例3中脐带血单个核细胞和复苏脐带血单个核细胞扩增培养的cik细胞冻存，具体步骤如下：

1、将收集的cik细胞计数后，分出50亿的cik细胞，用15ml的a冻存液重悬，轻轻吹打均匀，封口后，再次放过４℃冰箱中，放置20min；

2、从冰箱中取出a冻存液重悬且降温后的cik细胞，缓慢加入15ml的b冻存液，边加边轻轻搅拌；吹打均匀后，转移至50ml的冻存袋中，热合机封口；

3、将冻存袋放入特制的冻存盒中，转入-80℃超低温冰箱，24小时后，转存于液氮中，冻存。

4、液氮中保存1个月后，取出冻存免疫细胞，在40℃水水浴中快速复温，用pbs缓冲溶液洗涤两遍，取小样计数，测活率，并对细胞进行流式检测。

实施例4

免疫细胞nk冻存复苏

一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，具体步骤如下：

制备免疫细胞冻存液，包括a冻存液和b冻存液，其组分分别如下：

a冻存液：

人血白蛋白20ml

细胞稳定剂10ml

kbm581无血清培养基70ml

按上述组分配制a冻存液，放置于4℃冰箱保存，备用；

b冻存液：

医用dmso12ml

kbm581无血清培养基90ml

按上述组分配制b冻存液，放置于4℃冰箱保存，备用；

将实施例3中脐带血单个核细胞和复苏脐带血单个核细胞扩增培养的nk免疫细胞冻存，具体步骤如下：

1、将收集的nk免疫细胞计数后，分出50亿的nk细胞，用15ml的a冻存液重悬，轻轻吹打均匀，封口后，再次放过４℃冰箱中，放置20min；

2、从冰箱中取出a冻存液重悬且降温后的nk细胞，缓慢加入15ml的b冻存液，边加边轻轻搅拌；吹打均匀后，转移至50ml的冻存袋中，热合机封口；

3、将冻存袋放入特制的冻存盒中，转入-80℃超低温冰箱，24小时后，转存于液氮中，冻存。

4、液氮中保存1个月后，取出冻存免疫细胞，在40℃水水浴中快速复温，用pbs缓冲溶液洗涤两遍，取小样计数，测活率，并对细胞进行流式检测。

对实施例1至4的免疫细胞进行冻存前与复苏后的检测，检测结果如图1至图9所示。通过比对发现，用本发明的免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，对外周血或脐带血pmbc、cik免疫细胞、nk免疫细胞冻存，发现冻存前和冻存后复苏，细胞的活率几乎没有变化；进一步地，对外周血或脐带血pmbc冻存前和冻存后复苏进行cik免疫细胞和nk免疫细胞扩增培养，在扩增的过程中，细胞增殖的速率基本一致，扩增后得到的细胞的数量也相同，流式结果也基本一致；更进一步地，对扩增培养得到的cik免疫细胞和nk免疫细胞进行冻存后复苏发现其流式结果基本没有变化。所以，本发明的免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法对pbmc的冻存效果很优。

以上所述仅为本发明的较佳实话例子，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。