1.本发明属于水产养殖品种遗传育种技术领域，涉及一种生产四倍体牡蛎的方法及利用四倍体牡蛎进行种间杂交三倍体牡蛎的方法。
背景技术：
2.三倍体贝类具有三套染色体，因此具有生长快和不育的优良养殖形状，在贝类养殖中有很高的应用价值。三倍体贝类的商业化应用取决于获得四倍体贝类。四倍体贝类具有四套染色体，可以和二倍体杂交大规模生产100％三倍体贝类。但如何获得可以存活的四倍体贝类是一个挑战。
3.四倍体牡蛎可以通过用三倍体牡蛎卵子和正常二倍体精子受精，抑制极体释放获得(cn1144454a，cn100415085c，cn107494358a，cn109730008a)。四倍体牡蛎也可以用正常受精的二倍体卵子抑制极体释放获得(cn101677524b，cn108124801a)。目前生产四倍体的诱导方法存在不稳定、存活率或成功率很低的局限性，以至于在很多牡蛎中不能获得足够的四倍体，无法进行必要的优选和种间杂交。需要一个稳定高效的四倍体牡蛎生产和种间杂交方法。
4.不同学者对二倍体牡蛎种间杂交进行了初步研究，但由于四倍体牡蛎精子活力低，种间受精困难，目前尚没有大规模生产具有优良性状的种间杂交三倍体牡蛎的有效方法。
技术实现要素：
5.本发明目的在于提供一种生产四倍体牡蛎的方法及利用四倍体牡蛎进行种间杂交三倍体牡蛎的方法。
6.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
7.一种生产四倍体牡蛎的方法，在26
‑
28℃的高温下刺激三倍体牡蛎5
‑
8天，刺激后在22
‑
24℃水温下促熟30
‑
40天，促熟后选用卵子直径最大的雌牡蛎的卵子；将选择的卵子与二倍体牡蛎的精子受精5
‑
8分钟，再加入抑制剂对受精卵抑制第一极体排放，进而稳定获得大量四倍体牡蛎。
8.所述受精后受精卵经cb(0.5
‑
0.8mg/l)或6dmap(30
‑
80mg/l)诱导处理15
‑
20分钟，抑制第一极体排放；所述选择的卵子为选用卵子直径最大的卵子，其与二倍体精子数量按1：10
‑
20的比例混合。
9.所述特别人工升温促熟三倍体牡蛎为福建、太平洋或香港三倍体牡蛎，进行升温促熟后选取卵子直径最大的三倍体牡蛎的卵子与正常二倍体进行受精处理获得相应种的四倍体牡蛎。
10.一种利用种间杂交获得三倍体牡蛎的方法，经特别人工升温促熟三倍体牡蛎、选择大的三倍体牡蛎卵子和正常二倍体(2n)牡蛎精子受精，并抑制第一极体，稳定获得大量四倍体牡蛎，以供优选；利用优选所得四倍体牡蛎与不同种的优选二倍体牡蛎，在高浓度精
子下进行杂交，即获得种间杂交三倍体牡蛎。
11.所述四倍体牡蛎为在26
‑
28℃的高温下刺激三倍体牡蛎5
‑
8天，刺激后在22
‑
24℃水温下促熟30
‑
40天，促熟后选用卵子直径最大的三倍体牡蛎的卵子；将选择的卵子与二倍体精子受精5
‑
8min，再加入抑制剂对受精卵抑制第一极体排放，进而稳定获得大量四倍体牡蛎。
12.所述受精后受精卵经cb(0.5
‑
0.8mg/l)或6dmap(30
‑
80mg/l)诱导处理15
‑
20分钟，抑制第一极体排放。
13.所述选择的卵子为选用卵子直径最大的卵子，其与二倍体精子数量按1：10
‑
20的比例混合。
14.所述特别人工升温促熟三倍体牡蛎为福建、太平洋或香港三倍体牡蛎，进行升温促熟后选取选用卵子直径最大的三倍体牡蛎的卵子与正常二倍体进行受精获得相应种的四倍体牡蛎。
15.上述受精时海水和培育条件：采用25℃过滤并紫外线消毒的海水，太平洋牡蛎和福建牡蛎的海水盐度为千分之32，香港牡蛎的盐度为千分之16。受精卵孵化密度为50个卵/毫升，幼虫培养密度为10个/毫升。幼虫附着变态后，在海上养殖到成贝。
16.将上述获得不同物种中的优良四倍体牡蛎和与不同种的优良二倍体牡蛎，在高密度四倍体精子条件下进行人工受精杂交，获得具有优良养殖性状的种间杂交三倍体牡蛎。
17.选用上述获得个体最大的福建牡蛎四倍体雄贝与个体最大的太平洋牡蛎二倍体雌贝，用22
‑
25℃过滤并紫外线消毒的、盐度为千分之32的海水，按精子与卵子之间个数1：30
‑
60的比例混合进行人工受精杂交，产生太福杂交三倍体牡蛎；或，
18.选用上述获得个体最大的太平洋牡蛎四倍体雄贝与个体最大的福建牡蛎二倍体雌贝，用22
‑
25℃过滤并紫外线消毒的、盐度为千分之32的海水，按精子与卵子之间个数1：30
‑
60的比例混合进行人工受精杂交，产生福太杂交三倍体牡蛎。
19.选用上述获得个体最大的太平洋牡蛎四倍体雄贝与个体最大的香港牡蛎二倍体雌贝，用22
‑
25℃过滤并紫外线消毒的、盐度为千分子16的海水，按精子与卵子之间个数1：100
‑
200的比例混合进行人工受精杂交，产生香太杂交三倍体牡蛎。
20.选用上述获得个体最大的福建牡蛎四倍体雄贝与个体最大的香港牡蛎二倍体雌贝，用22
‑
25℃过滤并紫外线消毒的、盐度为千分子16的海水，按精子与卵子之间个数1：100
‑
200的比例混合进行人工受精杂交，产生香福杂交三倍体牡蛎。
21.所述方法可应用于其他牡蛎或贝类。
22.本发明所具有的优点：
23.本发明生产四倍体牡蛎并利用所获得的四倍体牡蛎进行种间杂交获得三倍体牡蛎，该方法可以稳定生产大量的四倍体牡蛎，而后进一步获得性状优良的种间杂交三倍体牡蛎，可以为牡蛎养殖提供优良品种；具体为：
24.1)本发明在获得四倍体过程中采用独特的人工升温程序，先用26
‑
28℃海水激发三倍体牡蛎发育，再把三倍体牡蛎放在23℃水温下促熟30
‑
40天，来获得更多更好的卵子；而现有的方法采取自然成熟的三倍体，无法获得大量高质量的卵子；
25.2)本发明在获得四倍体过程中利用大量的三倍体雌贝所产生的直径最大的卵子，卵子大成熟度高，更有利于四倍体存活；
26.3)目前杂交三倍体可以用正常的二倍体杂交精卵通过抑制第二极体诱导产生，但人工诱导的杂交三倍体倍化率和成活率低，无法应用于大规模生产；本发明通过上述获得大量的四倍体牡蛎让优选成为可能，用强力优选的四倍体牡蛎和优选的二倍体牡蛎杂交，用高浓度精子和特定选育条件，进而提供一个全新的生产优良杂交三倍体牡蛎的方法，本发明所生产的四个种间杂交三倍体具有优良性状和商业价值。
具体实施方式
27.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
28.实施例1
29.不同种的三倍体牡蛎的促熟：
30.分别取鉴定好的2龄人工诱导的三倍体太平洋牡蛎、三倍体福建牡蛎和三倍体香港牡蛎各100只，放入有16℃海水的亲贝培养池静养1天，其中太平洋牡蛎和福建牡蛎用千分之32的海水，香港牡蛎用千分之16的海水。从第2天起每天升温5℃，到第3天达到26℃，在26℃保持5天，每天按现有常规方式投饵料8次，倒池换水100％。从第8天起，把水温降到23℃，再每天按现有常规方式投饵料8次，倒池换水100％；在第38天全部达到性成熟,进而分别获得成熟的太平洋三倍体牡蛎、福建三倍体牡蛎和香港三倍体牡蛎。
31.实施例2
32.打开96只三倍体太平洋牡蛎，获得雌贝46枚，解刨取卵冲洗后分别放入46个烧杯中，从每个烧杯取样测量10个卵子的直径取平均值，把卵子直径最大的前15个烧杯里的卵子混合，共获得卵子2600万，稀释到10000卵/毫升。打开48只二倍体太平洋牡蛎，获得雄贝28只，解刨最大的15只取精子，过滤后等量混合。从受精后5分钟起，用cb(0.5mg/l)处理受精卵抑制第一极体，15分钟后冲洗，然后放入520升的水体孵化，孵化后按每毫升10个d型布池，正常培养。所有的处理操作都是在25℃下，用沙滤并紫外线消毒的海水，盐度为千分之32。
33.同时把剩余直径一般的卵子混合，作为大卵子组的对照，按同样方法受精、诱导和孵化，经过24小时后，受精卵发育成d型幼虫，此时用流式细胞仪检测两组d型幼虫的四倍体率，最大卵子组的四倍体率为86％，明显好于一般卵子对照组的12％。
34.经上述正常培养后幼虫发育到匍匐幼虫阶段，投入扇贝壳串附苗，七天后下海吊养，在海区养殖性成熟后，拿回车间活体取样，用流式细胞仪鉴定出四倍体太平洋牡蛎500枚。
35.同时取二倍体福建牡蛎500枚，取个体最大的50枚作为种贝(10％)，显微镜下鉴定获得雌性个体28枚，解刨取卵洗卵，获得卵子1.5亿；取个体最大的50枚上述获得四倍体太平洋牡蛎，显微镜下鉴定获得雄性个体18枚，解刨取精子过滤掉杂质。用高浓度精子即每个卵子30个活跃精子的比例加精子受精，海水盐度千分之32，用过滤海水做正常孵化和培养，用扇贝壳做附着基，获得福太三倍体苗600万枚，流仪鉴定50枚，100％三倍体。
36.另外，按照上述四倍体的获得方式培养，再次获得四倍体太平洋牡蛎，取个体最大的50枚四倍体太平洋牡蛎，进行下步操作，取二倍体香港牡蛎500枚，取个体最大的50枚作为种贝(10％)，显微镜下鉴定获得雌性个体21枚，解刨取卵洗卵，获得卵子1.8亿；取个体最
大的50枚上述获得四倍体太平洋牡蛎，显微镜下鉴定获得雄性个体25枚，解刨取精子过滤掉杂质。用高浓度精子即每个卵子150个活跃精子的比例加精子受精，海水盐度千分之16，用过滤海水做正常孵化和培养，用扇贝壳做附着基，获得香太三倍体苗80万枚，流仪鉴定50枚，100％三倍体。
37.实施例3
38.打开94只三倍体福建牡蛎，获得雌贝51枚，解刨取卵冲洗后分别放入51个烧杯中，从每个烧倍取样测量10个卵子的直径取平均值，把卵子直径最大的前15个烧杯里的卵子混合，共获得卵子1700万，稀释到10000卵/毫升。打开45只二倍体福建牡蛎，获得雄贝22只，解刨最大的15只取精子，过滤后等量混合。从受精后5分钟起，用cb(0.5mg/l)或6dmap(50mg/l)处理受精卵抑制第一极体，15分钟后冲洗，然后放入350升的水体孵化，孵化后按每毫升10个d型布池，正常培养。所有的处理操作都是在25℃下，用沙滤并紫外线消毒的海水，盐度为千分之32。
39.经上述正常培养后幼虫发育到匍匐幼虫阶段，投入扇贝壳串附苗，七天后下海吊养，在海区养殖性成熟后，拿回车间活体取样，用流式细胞仪鉴定出四倍体福建牡蛎500枚。
40.取二倍体太平洋牡蛎500枚，取个体最大的50枚作为种贝(10％)，显微镜下鉴定获得雌性个体23枚，解刨取卵洗卵，获得卵子2.4亿；取强力优选过的50枚上述获得四倍体福建牡蛎，显微镜下鉴定获得雄性个体21枚，解刨取精子过滤掉杂质。用高浓度精子即每个卵子30个活跃精子的比例加精子受精，海水盐度千分之32，用过滤海水做正常孵化和培养，用扇贝壳做附着基，获得太福三倍体苗1100万枚，流仪鉴定50枚，100％三倍体。
41.另外，按照上述四倍体的获得方式培养，再次获得四倍体福建牡蛎，取个体最大的50枚四倍体福建牡蛎，进行下步操作，取二倍体香港牡蛎500枚，取个体最大的50枚作为种贝(10％)，显微镜下鉴定获得雌性个体24枚，解刨取卵洗卵，获得卵子2.2亿；取个体最大的50枚上述获得四倍体福建牡蛎，显微镜下鉴定获得雄性个体19枚，解刨取精子过滤掉杂质。用高浓度精子即每个卵子150个活跃精子的比例加精子受精，海水盐度千分之16，用过滤海水做正常孵化和培养，用扇贝壳做附着基，获得香福三倍体苗120万枚，流仪鉴定50枚，100％三倍体。
42.将上述实施例获得种间杂交三倍体牡蛎于山东和福建按照相同的条件方式进行试养，福太杂交三倍体和太福杂交三倍体较山东当地的二倍体太平洋牡蛎壳高提高了12
‑
18％，鲜重提高了29
‑
41％，存活率提高了15
‑
20％；比较福建当地的二倍体福建牡蛎壳高提高了22
‑
30％，鲜重提高了58
‑
82％，存活率提高了28
‑
35％,明显好于当地的品种。在福建，香太杂交三倍体和香福杂交三倍体较福建当地的二倍体福建牡蛎壳高提高了20
‑
26％，鲜重提高了45
‑
66％，存活率提高了10
‑
18％，也明显好于当地的福建牡蛎。本发明所产生的四种种间杂交三倍体牡蛎，具有较高的生产应用价值。
43.实施例4
44.打开91只三倍体香港牡蛎，获得雌贝44枚，解刨取卵冲洗后分别放入44个烧杯中，从每个烧倍取样测量10个卵子的直径取平均值，把卵子直径最大的前15个烧杯里的卵子混合，共获得卵子1200万，稀释到10000卵/毫升。打开43只二倍体香港牡蛎，获得雄贝25只，解刨最大的15只取精子，过滤后等量混合。从受精后5分钟起，用cb(0.5mg/l)或6dmap(50mg/l)处理受精卵抑制第一极体，15分钟后冲洗，然后放入250升的水体孵化，孵化后按每毫升
10个d型布池，正常培养。所有的处理操作都是在25℃下，用沙滤并紫外线消毒的海水，盐度为千分之16。
45.经上述正常培养后幼虫发育到匍匐幼虫阶段，投入扇贝壳串附苗，七天后下海吊养，在海区养殖性成熟后，拿回车间活体取样，用流式细胞仪鉴定出四倍体香港牡蛎500枚，作为种贝。