耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制火龙果软腐病菌生长方面的应用

1.本发明涉及一种生防菌的合成生物学改造和应用，具体涉及耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制火龙果软腐病菌生长方面的应用。


背景技术：

2.火龙果是一种低能量的水果，富含水溶性膳食纤维，具有减肥、降低胆固醇、预防便秘、大肠癌等功效，还有丰富的纤维，能够预防便秘。火龙果中含有一般蔬果中较少有的植物性白蛋白，这种白蛋白会与人体内的重金属离子结合而起到解毒的作用。它富含抗氧化剂维生素c，能美白皮肤防黑斑。除此之外，火龙果中铁的含量也非常丰富。火龙果果实中的花青素含量较高，尤其是红肉的品种。花青素是一种效用明显的抗氧化剂，能有效防止血管硬化，从而可阻止心脏病发作和血凝块形成引起的脑中风；它还能对抗自由基，有效抗衰老；还能提高对脑细胞变性的预防，抑制痴呆症的发生。
3.火龙果软腐病病斑初期呈浸润状半透明，后期病部组织出现软腐状。潮湿情况下，病部流出黄色菌脓，发出腥臭，并且蔓延至整个茎节，最后只剩茎中心的木质部。此病多发生在植株中上部的嫩节，由伤口侵染引起，与虫咬和其它创伤有关；但对植株的危害严重，常造成发病节腐烂甚至向下和向上蔓延至其它茎节。如果苗期管理不善，田间土壤湿度过大，发病普遍。火龙果软腐病一般从10月就开始发病，1月下旬至3月上旬是发病盛期，至第二年4月份气温回升时病情减轻。该病具有发病急、蔓延快、危害大的特点，若不及时采取有效的防治措施，将会造成减产减收，严重影响火龙果生产。
4.常见的火龙果软腐病菌防治措施包括：
5.(1)田间措施
6.及时清洁田园，尤其要把病果清除带出田外烧毁或深埋。培育壮苗，增施嘉美红利、赢利来有机无机套餐系列营养，增强植株抗病力。适时定植，合理密植。雨季及时排水，尤其下水头不要积水，并保护地栽培要加强放风，防止棚内湿度过高，及时喷洒杀虫剂防治棉铃虫等蛀果害虫。
7.(2)药剂防治
8.雨前雨后及时喷洒72％农用硫酸链霉素可溶性粉剂4000倍液或新植霉素4000倍液、50％琥胶肥酸铜可湿性粉剂500倍液、77％可杀得可湿性微粒粉剂500倍液、47％加瑞农可湿性粉剂800～1000倍液、 30％碱式硫酸铜悬浮剂400倍液，采收前3天停止用药。
9.因此，近年来世界各国都在努力开发可替代传统化学药剂控制植物病害的新方法。其中利用微生物及其代谢产物进行生物防治，被公认为是一种环境友好型的选择。进一步地，利用合成生物学改造具有火龙果软腐病菌功能的生物系统，或者对火龙果软腐病菌具有生长抑制功能的生防菌，将其改造成高版本模式微生物底盘细胞，使其作为最小细胞工厂生产生物农药，将成为最为快捷有效的控制植物病害途径，为重要农作物病原菌的防治带来新的方向。


技术实现要素：

10.针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制火龙果软腐病菌(fusarium oxysporum)生长方面的应用，其中，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus boronitolerans p42) 于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏编号为cctcc no：m 2019773。
11.上述耐硼赖氨酸芽孢杆菌可用于制备抑制火龙果软腐病菌生长的杀菌剂。
12.上述耐硼赖氨酸芽孢杆菌可作为底盘细胞用于制备抑制火龙果软腐病菌生长的杀菌剂。
13.上述耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞为基础的改造模块可用于制备抑制火龙果软腐病菌生长的杀菌剂。
14.本发明中，所述抑制火龙果软腐病菌生长的杀菌剂包括耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液和辅料，耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的体积百分含量为10～90％。将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵滤液与辅料混合，制成含药平板，以不添加发酵液的平板作为对照；一般情况下，耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液与辅料以1：9的体积比混合，即发酵液占10％，而根据可以杀菌剂的贮藏条件可调节辅料的比例，例如辅料的体积百分含量可以为10％、25％、50％、75％等。其中：所述辅料为水、液体培养基、固体培养基、甘油中的一种或者多种，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液为耐硼赖氨酸芽孢杆菌经24～96小时培养，od
600
为 4.8～2.5时的发酵液，具体为耐硼赖氨酸芽孢杆菌以200ml菌液(初始od为0.02od
600
/ml)/500ml lb培养基的装液量，在37℃下以150r/min 转速培养96h，且菌液od值达到2.5时得到的发酵产物。
15.一种用于预防或治疗火龙果软腐病的方法，包括如下步骤：
16.步骤一、获取抑制火龙果软腐病菌生长的杀菌剂；
17.步骤二、将步骤一获取的抑制火龙果软腐病菌生长的杀菌剂与介质混合(用0.8cm打孔器打取火龙果软腐病菌的菌饼)，进而抑制介质表面致病菌的生长。其中，所述介质为携带火龙果软腐病菌的载体，所述载体为种子、植物、植物生长的土壤、培养植物的培养基中的一者或多者。
18.相比于现有技术，本发明具有如下优点：
19.耐硼赖氨酸芽孢杆菌不仅可以很大程度上降低火龙果软腐病的发生和危害，而且对生态环境没有影响，有望作为合成生物学研究的优质底盘微生物，为火龙果软腐病的防治带来新的方向。
20.保藏信息：
21.保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；
22.保藏单位简称：cctcc；
23.保藏地址：中国.武汉.武汉大学；
24.保藏日期：2019年10月8日；
25.保藏编号：cctcc no：m 2019773。
附图说明
26.图1是从土壤中分离并纯化的细菌基因组dna凝胶电泳分离图谱；
27.图2是用16s引物对基因组dna进行特异性扩增所获得pcr产物的凝胶电泳分离图
谱；
28.图3是通过序列比对后获得的潜在生防菌的系统进化树，通过序列比对分析，鉴定所获取的潜在生防菌是耐硼赖氨酸芽孢杆菌；
29.图4是耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液对火龙果软腐病菌的生长抑制作用，其中，a是实验组，在其培养基中混入了耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵96h后获得的无菌发酵滤液；b是对照组，未在其培养基中混入了耐硼赖氨酸芽孢杆菌的无菌发酵滤液。
具体实施方式
30.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
31.本领域技术人员应当理解，当陈述细菌经发酵、培养至一定浓度时，所说的浓度为一定数值范围内的浓度，例如当以od值表示浓度时，发明中若出现od
600
为4.8，则实际od值约为4.8，如od
600
值为4.8
±
0.6。将细菌发酵、培养至一定程度所需时间均为不能精确至分、秒的确定的时间，且所需时间与细菌发酵、培养的环境温度、培养基种类等均有关系，所以本发明中出现的与细菌发酵、培养、生长等相关的时间，均为大约的时间，而不是确定的时间。
32.本发明中出现的一些名词具有如下释义：
33.本发明所说的发酵液是指菌经发酵后产生的具有发酵产物的液体，例如耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液为耐硼赖氨酸芽孢杆菌以200ml 菌液(初始od约为0.02od
600
/ml)/500ml lb培养基的装液量，在37℃下以150r/min转速培养约24h、60h或96h得到的发酵产物。耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵时间约为24、60h和96h时，菌液od值分别约为 4.8、4.0和2.5(od值随着发酵时间的延长而降低)。发酵结束后，离心去除沉淀，收集发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤，即得到无菌的发酵滤液。
34.本发明所说的含毒介质法又叫生长速率法，是杀菌剂毒力测定的常规方法之一，适用于不长孢子而菌丝生长较快的真菌。通过菌落生长的速度快慢可以衡量药剂的毒力大小。含毒介质法是将供试药剂与培养基混合，以培养基上菌落的生长速度来衡量药剂的毒力大小。一般多用于那些不产孢子或孢子量少而菌丝较密的真菌。菌落生长速率一般通过菌落达到一个给定的大小所需要的时间(天或小时)，或者在单位时间内菌落直径的大小表示。
35.本发明所说的16s引物鉴定细菌是指运用pcr及序列比对等方法，确定待测细菌的种类。16s rdna是细菌染色体上编码16s rrna 相对应的dna序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。
36.细菌中包括三种核糖体rna，分别为5s、16s和23s rrna。其中，5s rrna虽易分析，但核苷酸数量太少，仅几十个核苷酸组成，导致遗传信息不足而不能用于分类研究；23srrna则因其分子量太大，所含有的核苷酸数量几乎是16s rrna的两倍，分析较困难而不选择其进行分类研究。通常将16s rrna用于细菌分类研究。
37.首先，16s rrna普遍存在于原核生物(真核生物中其同源分子是 18s rrna)中。
rrna参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16s rrna分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，16s rrna的相对分子量大小适中，约2kb个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。
38.16s rrna的编码基因是16s rdna，直接从细菌中提取16s rrna 很困难，且提取的rna易降解，不易保存等，因而通常利用16s rdna 鉴定细菌的种类。
39.本发明所述的od值是optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收的光密度。测量细菌培养液在600nm处的吸光值(用od
600
表示)，可以测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以600nm处的光密度值可以用于表示菌体细胞密度，其中，吸光值正比于培养液中的细菌的浓度。
40.本发明所说的生防细菌或者生防菌是指具有生物防治功能的一种或者多种细菌，是指利用有益微生物杀灭或压低病原生物数量以控制植物病害发生、发展的一类措施，又称“以菌治菌”。生物防治是病虫害综合治理体系的重要一环。它具有不污染环境、对人畜无毒、对植物无副作用等优点，对土传病害的控制尤其适用。
41.本发明所述pda培养基是指马铃薯葡萄糖培养基，其中p、d、 a即为pota to dextrose agar(medium)的缩写。pda培养基是一种常用的酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌培养基，是一种半合成培养基。
42.在生态环境中，一种微生物控制其他微生物生长的作用机制有很多种，不同的生防菌，以及同种生防菌在与不同植物作用时，可能有不同的生防机制。以木霉菌为例，生防菌的生防机制大体可分为竞争作用，如木霉菌对环境的适应性强，生长速度远比病原菌快，能与病原菌进行营养或空间竞争，有效地利用植物表面或侵入点附近低浓度营养物质迅速的占领空间吸收营养，占领病原菌的入侵位点而不为病原菌的入侵留下空隙；拮抗作用，如木霉菌可以产生的非挥发性代谢物强烈抑制棉花黄萎病菌生长，使病原菌菌丝出现细胞原生质浓缩和菌丝断裂等现象；诱导抗性作用，如绿色木霉穿透并定植在棉花根表皮和外皮层组织中，其过氧化物酶活性升高，萜类化合物积累，比没有被绿色木霉侵染的植株更有效地控制了病原菌感染，诱导了棉花的抗病性；寄生作用；抗生作用等。许多生防微生物是通过某一种单一机制起到生防作用的，也有部分微生物可通过集中不同机制之间的联合发挥功能。
43.本发明通过从土壤中分离、纯化出约100多株可能具有生防活性的细菌，以本实验室中现存的主要真菌病原菌作为靶标，检测分离细菌的生防特性。
44.实施例1：土壤菌株的分离、纯化
45.可以从可能存在生防细菌的任何土壤中分离、纯化细菌，检测其生防特性。本实施例中，取番茄-水稻轮作土壤，并对其中的细菌分离、纯化。
46.步骤1、制备土壤稀释液。称取适量的土壤。此处所说土壤为提前从野外取回的可能含有生防菌的土壤，也可以直接在野外称取土壤。称取10g土壤，将其混于100ml无菌水中，打碎后静置30分钟以上，充分析出土壤中的微生物，得到的上清液即为土壤原液。
47.将土壤原液稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍等，即可得到1g、10-1
g、10-2
g、10-3
g、10-4
g、10-5
g、10-6
g等土壤中微生物含量。此步骤便于获得土壤中微生物的单克隆。
例如，吸取10ml 土壤原液于0号试管中，再从本试管中吸取1ml土壤原液，混合于装有9ml无菌水的1号试管中，充分混合，是以将土壤原液稀释10 倍。依次操作，即可得到土壤原液稀释102倍、103倍、104倍、105倍、106倍的溶液。按土壤原液的稀释倍数，将试管分别标号为0，1， 2，3，4，5，6。
48.步骤2、涂板。从步骤1制作的7个试管中分别吸取溶液，移送至细菌固体培养基表面，并用刮刀、玻璃棒等工具将溶液其涂布均匀。晾晒至培养基表面较干燥，无液体状态后，利用封口膜将培养基封装。根据实验及统计的需求，可以将每个稀释度的溶液涂布于多个固体培养基表面。例如将每个稀释度的溶液均涂布于3个固体培养基表面。
49.步骤3、微生物培养。将细菌放置37度恒温环境中培养，如37 度恒温箱，水浴等，培养12小时以上。也可以将细菌放置在28度环境中培养，如28度恒温箱，水浴等，培养48小时以上。
50.步骤4、计数及菌落描述。计算每个固体培养基表面菌落个数，观察其菌落形态特征，并记录结果。例如，0号试管中为直接吸取的 10ml土壤原液，将其涂覆于固体培养基上，培养得到的菌落数目即为1g土壤中细菌数；1号试管中液体为将0号试管中溶液稀释10倍得到的，所以将其涂覆于固体培养基上，培养得到的菌落数目即为 0.1g土壤中细菌数，其他试管以此类推。
51.步骤5、平板划线分离。将上述步骤中得到的菌落划线分离，置于适合温度重新培养。如此操作，不仅可以将单克隆菌种分离，还可以对单克隆菌种扩繁和保存，且利于后续测序、分类试验。
52.步骤6、菌种保存和鉴定。
53.实施例2：鉴定菌株种类
54.用16s通用引物对菌株种类进行初步鉴定，可以直接将菌株作为底物进行菌种鉴定，也可以先提取基因组dna，将基因组dna作为底物进行菌种鉴定。本实施例中，使用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的细菌基因组dna含量、品质。图1为本实施例所提取的细菌基因组 dna琼脂糖凝胶电泳图，如图1所示，基因组dna的条带明显，浓度符合后续pcr实验的需求。
55.1、设计选择引物进行16s rdna的pcr扩增。可自行设计鉴定菌株种类的pcr引物，也可以选择常用的细菌鉴定通用引物进行pcr 扩增。本实施例中，选用通用引物27f和1492r进行pcr扩增，其中27f和1492r的dna序列如下：
56.27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；
57.1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’。
58.根据选取的不同dna聚合酶，选择适合的pcr反应体系以及反应条件。本发明不限定任何种类dna聚合酶的使用，也不限定使用同一种dna聚合酶后pcr反应体系与反应条件。例如，选用taq dna 聚合酶进行pcr扩增时，可参考如表1所列的反应体系：
59.表1 pcr体系表(12μl)
[0060][0061]
pcr的反应条件为：首先进行预变性，条件为94℃、5min，然后进入循环程序，每个循环程序是94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，进行30个循环，最后72℃保温7min。
[0062]
本实施例中，使用琼脂糖凝胶电泳检测以提取的基因组dna为模板经16s通用引物进行pcr后得到的dna片段的含量与品质。图 2为根据本实施例为根据所提取的细菌基因组dna为模板经16s通用引物进行pcr后得到的dna片段的琼脂糖凝胶电泳图。如图2所示，7组实验均得到条带单一、浓度符合后续测序鉴定需求的pcr产物。
[0063]
2、菌株种类鉴定。对上述实验得到的pcr产物测序处理。将得到的测序结果与现有菌种序列进行比对，最终得到所鉴定菌株的种类。例如，将测序得到的结果输入至ncbi网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast，即可得到所鉴定菌株种类。图3是采用16s引物对所分离的菌株进行pcr扩增获得16s rdna，并通过序列比对后获得的系统进化树，鉴定得到的生防菌是耐硼赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus boronitolerans p42)。该菌种已于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏编号为cctcc no：m 2019773。根据图3中所示的系统进化树，可以很清晰的看出本发明的耐硼赖氨酸芽孢杆菌与其他细菌种属的进化关系。
[0064]
实施例3：纯化细菌的生防特性鉴定
[0065]
采用含毒介质法对本发明分离出的潜在生防菌的抑菌活性进行鉴定。本实施例中，含毒介质法的具体操作为：
[0066]
1、配置pda固体培养基，并将其冷却至55℃左右；或者将已凝固的pda培养基加热融化并冷却至55℃左右；
[0067]
2、挑取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于lb液体培养基中， 37℃，150r/min过夜培养，次日转接菌液，以200ml菌液/500ml lb 培养基的装液量，至细菌浓度为0.02od
600
/ml，150r/min转速，置于恒温摇床37℃培养约24～96h，使得od
600
值达到4.8～2.5左右，在不同时间点分别收集发酵产物，置于离心机中，以8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，即得到无菌的发酵滤液；
[0068]
3、将发酵滤液与pda培养基以1：9的体积比混合，即发酵液占10％，制成含拮抗菌发酵液的含药平板；
[0069]
4、待混有发酵液的培养基冷却后，在平板中央接种1个供试病原菌菌饼(直径为8mm)；
[0070]
5、将接种后的培养基置于28℃恒温培养箱进行培养。
[0071]
以不含发酵液的pda培养基平板作为对照，以上步骤1～5重复至少三次，即做至少三个生防菌对特定细菌抑菌性测试实验。
[0072]
本发明中，通过以下公式评价生防菌的抑菌特性：
[0073]
菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.8)
×
100％
[0074]
图4为耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液对火龙果软腐病菌的生长抑制作用。其中，a是实验组，在其培养基中混入了耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵96h后获得的无菌发酵滤液；b是对照组，未在其培养基中混入了耐硼赖氨酸芽孢杆菌的无菌发酵滤液，培养基中间圆点为滴入的靶标病原菌，靶标病原菌为火龙果软腐病菌。
[0075]
结合图4及上述公式可以明显看出，火龙果软腐病菌的生长明显被耐硼赖氨酸芽孢杆菌抑制。经测算，耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵约96h 的发酵液对火龙果软腐病菌的拮抗效率约为79.1％。根据本发明的多次实验验证，耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵时间在96h，od
600
为2.5左右时，其可有效抑制火龙果软腐病菌生长，拮抗效率达到约79％左右。
[0076]
本实施例中，可以通过将生防细菌(例如本发明的耐硼赖氨酸芽孢杆菌)与介质混合，抑制致病菌生长，进而预防植物感染致病菌或者治疗已感染致病菌的植物。本实施例中，介质为任何可以携带致病菌的载体，例如介质可以包括火龙果幼苗，也可以包括火龙果生长的土壤、水环境，甚至培养植物的培养基等中的一者或者多者。致病菌可以是火龙果软腐病菌。当然，不应当限定致病菌的种类，本发明的耐硼赖氨酸芽孢杆菌可以一定程度上抑制其生长的细菌、真菌等都应视为本发明所说的致病菌。
[0077]
根据本实施例可知，耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵滤液中多种成分均对火龙果软腐病菌具有不同程度的抑制作用。所以，可以将耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘微生物底盘细胞，用于大量生产具有抑菌活性的发酵滤液，从而满足农业及生产生活上对杀菌剂的需求。
[0078]
根据本实施例，还可以将耐硼赖氨酸芽孢杆菌为基础进一步改进，将其改进为可以大量生产某一种或者多种具有特定抑菌活性的蛋白或者其他物质的改造模块，进而增强其制备的抑制火龙果软腐病菌生长的杀菌剂的功能，提高其制备抑制火龙果软腐病菌生长的杀菌剂的效率。
[0079]
根据本实施例，还可以将耐硼赖氨酸芽孢杆菌制作成杀菌剂，用以抑制火龙果软腐病菌等致病菌的生长。所述杀菌剂包括耐硼赖氨酸芽孢杆菌以及辅料，其中：杀菌剂中耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的发酵时间在96h，od
600
为2.5左右时其可有效抑制火龙果软腐病菌生长；辅料为水、液体培养，基、固体培养基、甘油中的一种或者多种，根据可以杀菌剂的贮藏条件调节甘油的比例，例如甘油的体积比可以为 10％、25％、50％、75％等。
[0080]
根据本实施例，还可以将本发明的耐硼赖氨酸芽孢杆菌与其他具有生物防治功能的细菌、真菌混合，制成对多种致病菌具有良好抑制作用的制剂。
[0081]
根据本实施例，预防或者治疗致病菌感染植物的方法包括如下步骤：将含有耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液与介质混合，进而抑制介质表面致病菌的生长，也可以直接将耐硼赖氨酸芽孢杆菌培养并调配至所需浓度后，将其与介质混合。其中，介质为任何可以携带致病菌的载体，例如介质可以包括火龙果幼苗，也可以包括火龙果生长的土壤、水环境，甚至培养植物的培养基等中的一者或者多者；致病菌可以是火龙果软腐病菌。当然，不应当限定致病菌的种类，本发明的耐硼赖氨酸芽孢杆菌以及与其混合的其他生防菌可以一定程度上抑制其生长的细菌、真菌等都应视为本发明所说的致病菌。
[0082]
火龙果软腐病是火龙果的重要病害，给农业生产造成了严重的经济损失。由于大
量使用化学农药给环境和食品也带来了巨大的威胁。耐硼赖氨酸芽孢杆菌不仅可以很大程度上降低火龙果软腐病的发生，而且于生态环境无任何威胁。进一步地，如可以通过对生防菌代谢物合成元件、装置的基础上，组装途径、合成模块，并模块或系统进行的理性修饰，从而产生更强效抑菌活性；或通过揭示基因线路和调控网络，合理设计或优化逻辑基因线路和功能基因线路，使之成为最小细胞工厂从而产生强效抑菌活性，则可以为火龙果软腐病的防治带来了新的方向。