专利名称:一种大叶藻无菌苗的培育方法
技术领域：
本发明属于海草种苗培育领域，具体涉及一种大叶藻无菌苗的培育方法。
技术背景
大叶藻是一种高等水生海草植物，由于其本身构造的特殊性，既具有水生植物的生长特性，同时具有陆生植物的生长特性。近年来，由于环境条件的改变和人为因素的干扰，导致大叶藻资源大量减少，为实现其持续利用，建立组织培养技术能在短时间内繁殖大量藻体，对保护和合理开发利用大叶藻具有重要的现实意义，为海水养殖提供健康环境，达到海水养殖和生态恢复的双赢。
高等植物的无菌苗组织培养技术已经相当成熟。2005年1月19日公开的公开号为CN1565172的《一种生长藏红花无菌苗的方法》，此方法是将藏红花的愈伤组织接种到含有稀土素的培养基上培养，得到藏红花体胚或胚性愈伤组织，再将体胚或胚性愈伤组织接种到稀土素培养基上培养，得到藏红花无菌苗；2006年3月1日公开的公开号为CN1739341 的《安祖花无菌苗组织培养和试管苗炼苗移栽技术》，选用安祖花幼嫩器官经组织培养获得无菌苗；2008年2月27日公开的公开号为CN101U9131的《朱顶红无菌苗再切割成苗方法》 选用朱顶红鳞茎进行组织培养获得无菌苗，以无菌苗进行组织培养；2009年6月10日公开的公开号为CN101451119的《一种商陆种子快速萌发的方法以及该方法在无菌苗培养中的应用》，提供了一种快速打破商陆种子的休眠状态，大大缩短了商陆种子的萌发以及成苗时间的方法。浓硫酸浸泡商陆种子可以达到消毒和打破种子休眠状态的作用，但同时浓硫酸也具有强大的腐蚀性。上述发明技术都是涉及高等陆生植物无菌苗培育。
上述已有技术存在的问题和不足在于，《一种生长藏红花无菌苗的方法》，选用愈伤组织作为外植体诱导无菌苗，愈伤组织的染色体倍型变化很大，不稳定；对于海藻而言， 诱导愈伤组织的技术还不成熟，愈伤诱导率极低，污染率很高，选择愈伤组织作为外植体培育无菌苗现实意义很小。《安祖花无菌苗组织培养和试管苗炼苗移栽技术》和《朱顶红无菌苗再切割成苗方法》采用的是植株的器官进行无菌苗的培育，难以保证拥有较嫩的培养组织，不可避免消毒剂对幼嫩组织的直接伤害；大叶藻的细胞壁很薄，消毒剂对细胞的直接伤害比陆生高等植物严重很多，很难保证培养的成活率。《一种商陆种子快速萌发的方法以及该方法在无菌苗培养中的应用》，以浓硫酸浸泡商陆种子来达到消毒和打破种子休眠状态的作用，大叶藻虽然具有陆生植物的生长特性，但没有陆生植物高级，种子构造没有商陆种子完善，因此不能忽视浓硫酸对种子本身的伤害作用，需要选择相对温和的消毒剂来达到消毒目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于沼生目大叶藻科种子植物无菌苗的培育方法，以克服现有技术的不足。
考虑到大叶藻是一种特殊的水生植物，具有种子，而且种子的收集方法简单易行，因此选用种子作为无菌苗培育的外植体，可以保证拥有较嫩的培养组织，避免消毒剂对幼嫩组织的直接伤害。
考虑到大叶藻种子采集于自然海域，其携带的杂藻和细菌种类和数量较多，种子的消毒对于实验的成功至关重要。为了保证种子的无菌性和成活率，采用70%的乙醇消毒 30s和10%的次氯酸钠消毒lOmin。
考虑到大叶藻种子的萌发季节为秋末冬初，低温刺激大叶藻种子的萌发。因此4°C 保存大叶藻一个月，低温打破其休眠状态。培养条件为温度22°C，弱光照lOOOLx，光照12h。
通常，培养海藻的培养基可以分为以下几大类培养褐藻的PES I ；培养红藻和绿藻的PES、MES、VAS培养基；培养一般海藻的Erdshreiber和ESS培养基。考虑到大叶藻是一种高等的水生海草植物，其内部构造上与海藻有很大的区别，一般的海藻培养基不能满足大叶藻的生长需要。MS培养基是组织培养常用的一种培养基，与其它培养基相比，MS培养基无机盐浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，这使得它营养极为丰富，不需要添加更多的有机附加物，能满足植物组织过程中植物对矿物质的需要。大叶藻是一种水生高等植物，生活环境与陆生植物不同，因此选用MS液体培养基，培养基的盐度与自然海水接近，盐度为30%。。
本发明通过种子的采集、消毒，接种MS培养基，无菌培养三个步骤，形成一整套严谨的无菌苗组织培养技术。
本发明是通过以下技术方案实现的
首先在大叶藻成熟季节6-7月份，从海水中用筛绢收集的大叶藻种子，4°C保存送至无菌室，且在4°C低温条件下保存一个月或更长时间以低温刺激打破种子休眠状态，促使其快速萌发；
在超净工作台内，将4°C保存的成熟种子以灭菌海水清洗干净，挑取结实饱满的大叶藻种子，用70%乙醇消毒30s，再放入10%的次氯酸钠中浸洗lOmin，用灭菌的海水冲洗干净后接种于冷却至20-25°C装有MS液体培养基的锥形瓶中，再将锥形瓶放在光照培养箱中培养。培养条件为温度22°C ；光照强度lOOOLx ；光照12h。
本发明用常规的MS液体培养基，将盐度调整为30%。，接近自然海水的盐度；MS液体培养基和海水高温(120°C )高压(103kPa)灭菌15min，冷却至20_25°C后用于接种和清
洗；每4天换一次培养基。
本发明可以在一年四季在室内培养大叶藻无菌苗而广泛提供种苗，为人工条件下实现大叶藻规模化组织培养快速繁殖体系做基础，为海草场的恢复奠定基础。本发明的方法可用于包括具茎大叶藻(Zostera caulescensMiki)，宽叶大叶藻(Zostera asiaticaMiki)禾口曰本大叶藻(Zosterajaponica Ascherson&Graebner)等沼生目大叶藻科大叶藻属的多年生草本植物种类。
具体实施方式
实施例1
大叶藻(hstera marina L.)的无菌苗培育方法
首先在大叶藻成熟季节6-7月份，从海水中用筛绢收集大叶藻种子，4°C保存送至无菌室，且在4°C低温条件下保存一个月或更长时间来以低温刺激打破种子休眠状态；在超净工作台内，用灭菌海水将低温保存的大叶藻种子清洗干净，挑取结实饱满的种子，用 70%乙醇消毒30s，再用10%次氯酸钠消毒lOmin，用灭菌海水冲洗干净后接种于装有MS液体培养基的锥形瓶中；将锥形瓶放在光照培养箱中培养，培养条件为温度22°C，光照强度 IOOOLx,光照12h，每4天换一次培养基。
本发明所用的MS液体培养基，盐度为30%。;MS液体培养基和海水高温(120°C )高压(103kPa)灭菌15min，冷却至20-25°C后用于接种和清洗。
待5天后，大叶藻种子吸水膨胀，且伴有萌发的迹象；第10天种子萌发，胚根长出； 第20天，即有种子发芽，培养至种苗长2-3cm。
实施例2
丛生大叶藻(Zostera caespi tosa Miki)的无菌苗培育方法
本实施例2的无菌苗培育方法与实施例1同。7天后，丛生大叶藻种子吸水膨胀， 并且伴有萌发的迹象；第12天种子种子萌发，胚根长出；第25天，种子发芽，培养至种苗长 2_3cm0
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权利要求
1.一种大叶藻无菌苗的培育方法，其特征是首先在大叶藻成熟季节6-7月份，从海水中用筛绢收集大叶藻种子，在4°C低温条件下保存一个月或更长时间以低温刺激打破种子休眠状态；在无菌条件下用灭菌海水将该保存的大叶藻种子清洗干净，挑取结实饱满的种子，再用70%乙醇消毒30s，再放入10%的次氯酸钠中浸洗lOmin，用灭菌的海水冲洗干净后接种于装有MS培养基的锥形瓶中；将锥形瓶放在光照培养箱中培养，培养条件为温度 22°C，光照强度lOOOLx，光照12h ；每4天换一次培养基；其中所述的MS培养基是液体培养基，盐度为30%0。
2.如权利要求
1所述的大叶藻无菌苗的培育方法，其特征是上述灭菌海水是经由高温 120°C和高压103kPa灭菌15min，冷却至20_25°C后制得。
专利摘要
本发明涉及一种大叶藻无菌苗的培育方法，是将收集的大叶藻种子在4℃低温条件下保存一个月或更长时间，以低温刺激打破种子休眠状态。然后在无菌条件下用灭菌海水将低温保存的大叶藻种子清洗干净，挑取结实饱满的种子，用70％乙醇消毒30s，再用10％次氯酸钠消毒10mi n，用灭菌的海水冲洗干净后接种于装有MS液体培养基的锥形瓶中；将锥形瓶放在光照培养箱中培养，培养条件为温度22℃，光照强度1000Lx，光照12h，每4天换一次培养基，培养至种苗长2-3cm。本发明可以一年四季进行培育，保障了大叶藻规模化养殖的种苗供应。本发明还适用于沼生目大叶藻科大叶藻属其他种的无菌苗培育。
文档编号A01H4/00GKCN101904304 B发布类型授权 专利申请号CN 201010227834
公开日2012年1月4日 申请日期2010年7月16日
发明者刘岩, 吴茜, 宫庆礼, 李景玉, 王巧晗 申请人:中国海洋大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan