专利名称：利用替代宿主生产松毛虫cpv杀虫剂的新方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒杀虫剂的生产方法，具体地说就是利用替代宿主生产松毛虫CPV杀虫剂的新方法。
松毛虫质型多角体病毒(Cytopllasmic Polyhedrosis Viruses简称CPV)是松毛虫的一种天然病原体。松毛虫CPV杀虫剂对防治松毛虫具有持续高效、对人畜安全无毒等特点。1974年，赤松毛虫CPV在日本进行了注册登记，成为世界上第一个注册登记使用的CPV杀虫剂。80年代初，我国开始分离、研究松毛虫CPV病原体，经国家“七·五”至“九·五”攻关逐步发展到目前国内外采用围栏以松毛虫增殖松毛虫病毒制备杀虫剂技术，由于围栏生产技术存在着被感染虫龄不一，受外界环境条件诸多因素制约的影响，其生产方法不仅病毒产量极不稳定，且费工费时，难以实现病毒生产的产业化。故此，有人试图用棉铃虫作为增殖松毛虫CPV的替代宿主，但所获病毒经RNA图谱分析，病毒非松毛虫CPV而是棉铃虫自身CPV被激活。
目前，国内外生产昆虫病毒有两种方式，一是用细胞培养，二是用活虫体。前者因生产成本过高，难以实现产业化，第二种方法即适用于许多病毒杀虫剂的生产。然而，用松毛虫生产松毛虫病毒则存在着两个不可愈越的障碍，一是松毛虫毒毛极毒，人工饲养松毛虫易于造成工人的皮肤过敏，严重者将导致皮肉溃烂；二是因松毛虫对食物的选择性极强，目前，人工饲料饲养松毛虫技术还没有突破。
本发明的目的在于提供一种生产松毛虫CPV杀虫剂的新方法，该方法是利用银纹夜蛾作为生产松毛虫CPV的替代宿主，用人工饲料群体饲养银纹夜蛾，再经后处理加工得到松毛虫CPV杀虫剂。
为实现本发明所采取的技术措施如本发明申请人自80年代开始研究松毛虫CPV，是国内最早从事松毛虫CPV研究者。用松毛虫CPV感染银纹夜蛾(Argyrogramma agnata)替代宿主获得了成功。经替代宿主增殖的病毒不仅RNA图谱、蛋白质结构多肽与原松毛虫CPV相同，而且毒力相当，用替代宿主生产的松毛虫CPV杀虫剂对文山松毛虫、德昌松毛虫、马尾松毛虫具很好的防效。本项新技术解决了银纹夜蛾在廉价人工饲料上长期继代饲养技术，这就使得利用替代化宿主工厂生产松毛虫CPV杀虫剂成为可能，生产成本大大降低。
适用于本发明，用银纹夜蛾替代宿主增殖或生产的松毛虫病毒的种类有文山松毛虫CPV、德昌松毛虫CPV、马尾松毛虫CPV。
一、银纹夜蛾人工饲料配方黄豆粉 10-12％ 麸皮 10-12％酵母粉 4-5％ 蔗糖 0.4-0.8％琼脂(或代用品) 1.5-2％ 菜油 0.4-0.8ml％维生素C 0.5-1％ 山梨酸0.16-0.2％尼泊金 0.16-0.2％金霉素1-1.5％余量为水。
二、银纹夜蛾的饲养技术将配制的人工饲料分装于为24cm、高为5.5cm、经消毒的圆型塑料盒中，再将经人工饲料长期继代同步化的银纹夜蛾适量卵块条(约300粒卵)粘于养虫盒盖被面上；将孵化盒放入21-28℃、相对湿度为70％-80％、光照L∶D＝12∶12hr的养虫室，待幼虫孵化直至化蛹。收取健康蛹，在5-10％甲醛液中消毒的漂洗、凉干后放入产卵笼内，保持80％湿度。成虫羽化后，将5W白炽灯放在产卵笼的一端，引诱雌蛾产卵于白纸上。每天定时更换产卵纸，卵纸经5-10％甲醛消毒、漂洗、凉干，再根据卵纸上卵粒的密度，将卵纸剪成不同大小放入养虫盒，进入下一次生活周期再循环。
三、用松毛虫CPV感染银纹夜蛾技术病毒初品经两个轮次差异离心去渣，一次蔗糖梯度离心纯化，经计数置4℃冰箱备用。将1×104--1×105PIB/ml的病毒悬液均一喷在养虫盒内的人工饲料上，感染银纹夜蛾幼虫，从感染后的第八天开始收集患病死虫直至第十五天左右结束。
四、病毒杀虫剂的后处理加工技术将患病死虫匀浆捣碎，栏式离心机(500rpm/min)离心，过200目尼龙网，去渣，滤液经计数后，定量加入200目填充料(如轻质碳酸钙、滑石粉等)，喷雾干燥制备成可湿性粉剂，或不经干燥直接制备成乳悬剂。
本发明利用银纹夜蛾作为替代宿主生产松毛虫CPV杀虫剂，该方法经廉价的人工饲料对银纹夜蛾进行群体饲养，从而可实现幼虫的同步化率高，并可批时生产，经替代宿主增殖的病毒不仅RNA图谱、蛋白质结构多肽与原松毛虫CPV相同，而且毒力相当；用替代宿主生产的松毛虫CPV杀虫剂对文山松毛虫、德昌松毛虫、马尾松毛虫具很好的防效。加之本发明解决了银纹夜蛾在廉价人工饲料上长期继代饲养技术，这就使得利用替代宿主工厂化生产松毛虫CPV杀虫剂成为可能，生产成本大大降低。
经放大生产的结果表明，用银纹夜蛾替代宿主生产文山松毛虫CPV、德昌松毛虫CPV和马尾松毛虫CPV的产量比用天然宿主围栏增殖法生产松毛虫CPV的产量至少高于50％，生产周期缩短5-6天。可大大降低生产成本。
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明实施例用1×105PIB/ml文山松毛虫CPV悬液喷雾感染人工饲料上3龄银纹夜蛾幼虫，待发病幼虫死亡后收集于容器内，置4℃冰箱保藏，在制备杀虫剂时，加入适量磷酸缓冲液(PBS)捣碎虫体，用500rpm/min过200目尼龙纱去渣，用血球计数法计数悬液中的多角体含量，离心去渣后的病毒悬液即可加乳油制备成松毛虫CPV乳悬剂，也可加轻质碳酸钙或滑石粉，经喷务干燥制备成可湿性粉剂。
替代宿主增殖的松毛虫病毒，经实验室毒力测定，对文山松毛虫、德昌松毛虫和马尾松毛虫的杀效分别为88.5％，82％和75.6％，林间防治效果平均为80.2％，表明其杀虫效果与天然宿主增殖的松毛虫病毒相当。每亩使用乳悬剂用量50ml，使用可湿性粉剂50-100克，含5-10×109PIB/亩。
权利要求
1.一种生产松毛虫CPV杀虫剂的新方法，其特征在于该方法是以银纹夜蛾作为生产松毛虫CPV的替代宿主，用松毛虫CPV感染3龄幼虫，收集感染后8至15天的死虫，匀浆捣碎，经心分离病毒，再经后处理加工得到松毛虫CPV杀虫剂。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的松毛虫CPV为文山松毛虫CPV、或德昌松毛虫CPV、或马尾松毛虫CPV。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的银纹夜蛾为经人工饲料继代同步化的银纹夜蛾。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于所述的人工饲料配方黄豆粉10-12％ 麸皮 10-12％酵母粉4-5％ 蔗糖 0.4-0.8％琼脂或代用品 1.5-2％ 菜油 0.4-0.8ml％维生素C 0.5-1％ 山梨酸0.16-0.2％尼泊金0.16-0.2％金霉素1-1.5％余量为水。
全文摘要
本发明公开了一种生产松毛虫CPV杀虫剂的新方法,该方法是利用银纹夜蛾作为生产松毛虫CPV的替代宿主,在人工饲料群体饲养银纹夜蛾,用松毛虫CPV感染后收集患病死虫,再经后处理加工制备松毛虫CPV杀虫剂。该方法以廉价的人工饲料对银纹夜蛾进行群体饲养,饲养方便,可批量生产,成本低,所得杀虫剂对文山松毛虫CPV、德昌松毛虫CPV、马尾松毛虫CPV具有很好的防治效果。
文档编号A01N63/02GK1262870SQ9911635
公开日2000年8月16日 申请日期1999年2月10日 优先权日1999年2月10日
发明者孟小林, 姜小文, 徐进平, 叶林柏, 郜金荣, 钟铁柱 申请人:武汉大学