种的黑麦属（Friebe，etal. 1991)、山羊属（Sears, 1956)、簇毛麦属（Chenet al, 1995)以及偃麦草属（Friebeetal, 1991;Sharmaetal. 1997;Ohmetal, 2005;Zhang etal，2004 ;郝薇薇等，2012)等多个易位系。但是对于偃麦草属的研宄大部分都是中间偃 麦草和十倍体长穗偃麦草，却很少看到关于二倍体长穗偃麦草易位系的研宄报道。本实验 首次利用辐射的方法获得小麦二倍体长穗偃麦草易位系，小麦的染色体上易位了二倍体长 穗偃麦草7E染色体的片段，这个片段上可能携带对小麦赤霉病具有抗性的基因。
【发明内容】
[0037] 本发明的目的是提供一种小麦-长穗偃麦草抗赤霉病7E染色体长臂易位系的培 育方法，该方法是利用6tlCo辐射处理小麦-长穗偃麦草7E代换系与Y16杂交F2代种子，通 过形态、分子标记和焚光原位杂交三者相结合的方法筛选小麦-长穗偃麦草7E染色体长臂 抗赤霉病易位系。
[0038] 本发明所述的小麦-长穗偃麦草7E染色体长臂抗赤霉病易位系的培育方法，包括 以下步骤：
[0039] 1)中国春-长穗偃麦草7E7B代换系与扬麦16杂交，杂交F1R种子自交获得F2R 种子，将F2代种子进行6tlCo(钴60)辐射，即M1;
[0040] 2)种植M1代种子，选择具有长穗偃麦草形态学特征并且赤霉病抗性高于阴性对照 An8455和中国春、扬麦16的单株收获，即收获仏种子；
[0041] 3)将M2代种子自交，单株提取M2代植株基因组DNA，首先用E基因组分子标记 SM1-7E_1、SM1-7E_2、P7E_No. 32和P7E_No. 36进行PCR检测，选择至少有一个E基因组分 子标记出现条带的样本，再用长穗偃麦草7E长臂特异分子标记P7E_No. 7、P7E_N〇. 20、P7E_ No. 24、P7E_No. 31、P7E_No. 37、P7E_No. 49、P7E_No. 52、P7E_No. 53 和P7E_No. 56 进行鉴定， 选择出其中至少检出I个7E长臂特异分子标记植株进行赤霉病抗性检测；收获赤霉病抗性 高于An8455、中国春、扬麦16的单株；即收获M3种子；
[0042] 4)将M3代种子自交，选择鉴定方法同步骤3)，单株收获M4种子；即先后进行E 基因组分子标记、7E长臂特异分子标记和植株进行赤霉病抗性检测，收获赤霉病抗性高于 An8455、中国春、扬麦16的单株；
[0043] 5)室内发芽M4代种子，取根尖进行细胞学制片，选择好的细胞制片进行基因组原 位杂交（GISH);结合长穗偃麦草7E长臂特异分子标记鉴定结果，筛选出小麦-长穗偃麦草 7E染色体长臂抗赤霉病易位系。
[0044] 在具体的实践中，通过本发明方法获得3个小麦-长穗偃麦草7E染色体长臂抗赤 霉病易位系（W-7EL1，W-7EL2，W-7EL3);现有3个易位系的9个株系。所获小麦-长穗偃麦 草7E染色体长臂抗赤霉病易位系有的已经纯合稳定，可用于长穗偃麦草中赤霉病抗性基 因的定位，可在小麦的遗传育种和品质改良中作为亲本，可以参与抗赤霉病小麦的育种，也 可以继续辐射处理筛选获得小麦-长穗偃麦草7E染色体长臂抗赤霉病小片段易位系。 [0045] 本研宄利用60C〇 (钴60)辐射处理小麦-长穗偃麦草7E代换系与扬麦16杂交的 F2代种子，在辐射后代的繁殖过程中，首先进行田间赤霉病抗性筛选，选择赤霉病抗性高 又具有长穗偃麦草相关特征的植株单株种植。在此基础上利用长穗偃麦草7E染色体长臂 特异标记对获选单株进行检测，最后通过细胞学进行小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系确 认。利用田间表现型筛选、分子标记鉴定和细胞学确认三种方法相结合，创建了小麦-长穗 偃麦草7E染色体长臂抗赤霉病易位系。本研宄所获抗赤霉病易位系为小麦品种改良和遗 传研宄提供新种质或基础材料，可作为亲本参与抗赤霉病小麦的培育。在该易位系参与的 杂交后代中，农艺性状的选择可按常规进行，而赤霉病抗性早代可借助分子标记辅助选择， 保留农艺性状良好并具有长穗偃麦草7E染色体片段的单株进行繁殖，而在后代再进行赤 霉病的接种鉴定，可以节省早代赤霉病接种鉴定，并获得具有长穗偃麦草抗赤霉病种质的 小麦高产品种。另外，本研宄所获得的整臂易位系，利用该种质材料继续辐射和选择，将会 得到抗赤霉病的小麦-长穗偃麦草7E染色体长臂小片段易位系，为偃麦草属中抗赤霉病基 因的深入研宄奠定了材料基础。
【附图说明】
[0046] 图1.分子标记的稳定性和特异性鉴定结果
[0047] M为marker2501, 1-6 分别为 1:DA7E2:DA7ES3:2X4:DA7EL5:CS6:Y16
[0048] 图2.M2代分子标记鉴定结果
[0049] M为marker2501，1-18为仏代各单株，阳性对照2X和阴性对照Y16
[0050] 图3.M3代分子标记鉴定结果
[0051]M为marker2501，1-21为％代各单株，阳性对照位2X，阴性对照CS和Y16
[0052] 图4.M4代基因组荧光原位杂交鉴定结果
【具体实施方式】
[0053] 实施例1
[0054] -、实验材料
[0055]普通小麦中国春（CS)，二倍体长穗偃麦草（EE) (2X)，中国春-长穗偃麦草二体代 换系：DS7E7A、DS7E7B;中国春-长穗偃麦草二体附加系：DA7E、DA7EL、DA7ES(以上5个材料 由加拿大农业部的Dr.Fedax惠赠，材料原始文献为《Disomicandditelosomicadditions ofdipIoidAgropyronelongatumchromosomestoTriticumaestivum》）；扬麦 16(Y16,艮P 扬0-126是江苏里下河地区农科所用扬91F138和扬90-30杂交育成），上述材料由江苏省 里下河农科所提供，均有市售；安农8455 (An8455,安徽农科院育成）、苏麦3 (Su3,苏州地区 农科所于1968年利用Funo和台湾小麦育成）号为实验室自有品种）。
[0056] 二、基因组DNA的提取
[0057] 供试材料生长至两叶一心期，以SDS法提取基因组DNA。其步骤如下：
[0058] (1)取幼嫩叶片（约0.lg)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用研磨棒 碾碎至粉末状；
[0059] (2)离心管放置于室温稍冷却，加入700y1的缓冲液A，轻轻混匀，然后65°C水浴 20min，期间每隔5min上下颠倒混勾一次；
[0060]
【主权项】
1.小麦-长穗偃麦草7E染色体长臂抗赤霉病易位系的培育方法，包括以下步骤： 1) 中国春-长穗偃麦草7E7B代换系与扬麦16杂交，杂交F1代种子自交获得F 2代种 子，将F2代种子进行6tlCo (钴60)辐射，即M1; 2) 种植M1代种子，选择具有长穗偃麦草形态学特征并且赤霉病抗性高于阴性对照 An8455和中国春、扬麦16的单株收获，即收获仏种子； 3) 将M2代种子自交，单株提取M2代植株基因组DNA，首先用E基因组分子标记 SM1-7E_1、SM1-7E_2、P7E_No. 32和P7E_No. 36进行PCR检测，选择至少有一个E基因组分 子标记出现条带的样本，再用长穗偃麦草7E长臂特异分子标记P7E_No. 7、P7E_N〇. 20、P7E_ No. 24、Ρ7Ε_Νο· 31、Ρ7Ε_Νο· 37、Ρ7Ε_Νο· 49、Ρ7Ε_Νο· 52、Ρ7Ε_Νο· 53 和 Ρ7Ε_Νο· 56 进行鉴定， 选择出其中至少检出1个7Ε长臂特异分子标记的植株进行赤霉病抗性检测；收获赤霉病抗 性高于An8455、中国春、扬麦16的单株；即收获M 3种子； 4) 将M3代种子自交，选择鉴定方法同步骤3)，单株收获M 4种子； 5) 室内发芽M4代种子，取根尖进行细胞学制片，选择好的细胞制片进行基因组原位杂 交；结合长穗偃麦草7E长臂特异分子标记鉴定结果，筛选出小麦-长穗偃麦草7E染色体长 臂抗赤霉病易位系。
【专利摘要】本发明涉及小麦-长穗偃麦草7E染色体长臂抗赤霉病易位系的培育方法。本研究利用60Co辐射处理小麦-长穗偃麦草7E代换系与扬麦16杂交的F2代种子，在辐射后代的繁殖过程中，首先进行田间赤霉病抗性筛选，选择赤霉病抗性高又具有长穗偃麦草相关特征的植株单株种植。在此基础上利用长穗偃麦草7E染色体长臂特异标记对获选单株进行检测，最后通过细胞学进行小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系确认。利用田间表现型筛选、分子标记鉴定和细胞学确认三种方法相结合，创建了小麦-长穗偃麦草7E染色体长臂抗赤霉病易位系；所获抗赤霉病易位系为小麦品种改良和遗传研究提供新种质或基础材料，可作为亲本参与抗赤霉病小麦的培育。
【IPC分类】C12Q1-68, A01H1-02
【公开号】CN104585018
【申请号】CN201510019098
【发明人】陈建民, 张璐璐, 高勇, 陈士强, 刘慧萍, 黄泽峰, 秦树文, 黄帅
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月14日