鉴定长穗偃麦草E组染色体的TRAP-SCAR₂₅₂标记及其应用的制作方法

专利名称：鉴定长穗偃麦草E组染色体的TRAP-SCAR₂₅₂标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于长穗偃麦草E组染色体鉴定的技术领域，涉及一种鉴定长穗偃麦草E 组染色体的TRAP-SCARm2标记及其应用。
背景技术：
小麦是世界上重要的粮食作物之一。在中国它是仅次于水稻的第二大农作物，小麦生产对国民经济发展有着十分重要的战略意义。由于小麦栽培品种单一化，使其遗传基础日益狭窄，抗源匮乏，极大地限制了其产量和品质的进一步改良。小麦的近缘物种中存在着大量的遗传变异，是小麦改良可以利用的有益基因资源，将这些有益基因导入小麦一直是遗传学家和育种学家经久不衰的研究课题。偃麦草属是小麦的一个近缘种属，它具有普通小麦缺少的许多优良性状，如分蘖能力强，根系发达，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐盐碱力强，多花、大穗、多实，籽粒蛋白含量高以及优良的烘烤品质，抗多种病害能力强，对小麦条锈病、 叶锈病、杆锈病、白粉病、黄矮病、条纹花叶病及腥黑穗病高抗至免疫，是小麦遗传育种的重要亲本之一。长穗偃麦草(Agropyron elongatum)是小麦的一个重要近缘种，具有蛋白质含量高、抗多种真菌和病毒病害、耐旱、耐寒、大穗多花等优异性状，是在小麦品种改良中应用最广泛的野生种之一。在自然界，长穗偃麦草有二倍体、四倍体和十倍体3种倍性类型。其中二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum) E组染色体是组成偃麦草属(Elytrigia)多倍体物种的基本染色体组，携带有对小麦遗传育种有益的基因，但对于四倍体和十倍体类型的染色体组构成，一直没有一致的结论。通过远缘杂交及染色体工程的方法从普通小麦野生近缘种属转移优良基因的方法已被实践证明是一条卓有成效的途径。目前，国外从长穗偃麦草中成功转移了 Sr24 (3DL)，Sr26 (6AL)，Sr25 (7DL，7AL)，Lr 19, Lr24等基因。国内从小麦与长穗偃麦草杂种后代中育成了小偃4号、5号、6号、小偃107等小麦品种。通过杂交和渐渗的方式是将外源染色体的优良性状和优异基因导入小麦的一种有效的方法，但是，在重组的小麦中，源于小麦-长穗偃麦草杂交后代的外源E组染色质或染色体的检测成为至关重要的问题，虽然通过农学上的重要特性以及生化分析已将有价值的基因绘图在长穗偃麦草染色体上，但这些实验的检测手段是不稳定的，而且不适合进行重要的农学性状的检测。有一些遗传学手段，如染色体分带、原位杂交等技术，已经将其用于小麦遗传背景下外源遗传物质的检测，但这些技术费时、费力，对技术的要求也很高，而且用这些实验手段进行大规模的后代快速筛选依然存在一定的局限。所以，迫切要求开发一种可以在小麦遗传背景下快速、准确、大规模的鉴定长穗偃麦草外源染色质或染色体的分子标记技术。靶位区域扩增多态性(TRAP)是一种新型的基于PCR的分子标记，由美国农业部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出，它借助大规模测序技术产生的许多生物的大量序列信息，利用生物信息学工具和表达序列标签(expressed sequence tag, EST)数据库信息设计引物，对目标候选基因序列区进行扩增产生多态性分子标记，该标记技术已广泛应用于动植物的研究中，主要在种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、绘制基因组转录图谱、重要的性状标记、比较基因组学、亲缘关系和遗传多样性等方面取得了进展。目前，该标记已经在水稻、大麦、小麦、菜豆、向日葵、甜菜等植物中得到成功应用。

发明内容
本发明解决的问题在于提供一种鉴定长穗偃麦草E组染色体特异TRAP-SCAR252标记及其应用，为快速、准确地鉴定小麦遗传背景下的外源长穗偃麦草E组染色质或染色体
奠定基础。本发明是通过以下技术方案来实现一种鉴定长穗偃麦草E组染色体的标记基因，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3或 SEQ. ID. NO. 6 所示。一种扩增SEQ. ID. NO. 3所示的标记的引物对，其上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2 所示。一种扩增SEQ. ID. NO. 6所示的标记的引物对，其上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5 所示。SEQ. ID. NO. 6所示的序列作为SCAR标记应用于小麦遗传背景下的长穗偃麦草5E 或6E染色体的鉴定或跟踪检测。所述的应用是基于长穗偃麦草5E或6E染色体体系培育小麦品种的分子标记辅助育种。所述的应用是以SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物对待测基因组进行PCR扩增，然后根据扩增产物的电泳结果，对是否含有长穗偃麦草5E或6E染色体进行判定。所述的PCR扩增的扩增程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s，M°C退火30s， 72°C延伸60s，30 35个循环；72°C延伸lOmin。若扩增产物的电泳结果当中含有252bp的目标片段，则待测基因组中含有长穗偃麦草5E或6E染色体；若扩增产物的电泳结果当中没有252bp的目标片段，则待测基因组中没有长穗偃麦草5E或6E染色体。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明采用多个引物组合利用TRAP分子标记技术对“中国春”小麦、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草三种材料进行长穗偃麦草E组染色体的多态性的分析，筛选出长穗偃麦草E组染色体的TRAP特异片段，然后再将其转换为稳定的SCAR标记；这样的 SCAR标记具有了长穗偃麦草E组染色体的特异性，提高了检测的准确性，非常有利于小麦遗传背景下的长穗偃麦草E组染色体的鉴定和跟踪检测。与现有的鉴定方法相比，利用该 SCAR标记进行鉴定则无疑正确率要明显提升，而且是十分方便、快捷的。2、本发明获得的SCAR标记称为SCAR252，利用普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草材料进行了 SCAR标记验证，在二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草中扩增出了 252bp的片段，而在普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系中没有该产物，初步证明此标记可以用于长
4穗偃麦草E组染色体的检测。进一步用该对SCAR引物对“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系与“中国春”-长穗偃麦草5E 二体附加系的杂种F1代、F2代进行了分析，结果在全部F1代以及部分 F2代材料中扩增出了目的片段，进一步证明了此SCAR252标记可以用来检测小麦背景下的长穗偃麦草E组染色体，为小麦背景中长穗偃麦草E组染色体的快速跟踪检测提供了新途径。3、所用到的SCAR标记的检测，使用的PCR反应体系，不需要特殊的PCR反应仪器和特殊的反应试剂，与其它普通PCR反应要求一样；只需要在PCR扩增之后通过电泳检测， 就可以根据电泳结果有无大小相同的目的条带进行判定，操作简单方便。4、本发明提供的长穗偃麦草E组染色体的标记，通过SCAR标记的检测，为快速鉴定小麦遗传背景下的长穗偃麦草E组外源染色质或染色体奠定了良好的基础，同时也为分子标记辅助育种提供了十分方便快捷的途径。


图1为TRAP引物在三种不同材料中的扩增结果，泳道1为普通小麦“中国春”，泳道2为二倍体长穗偃麦草，泳道3为四倍体长穗偃麦草(Marker :DL2000)；图2为核苷酸序列SEQ. ID No. 3 (称为RGA-11F ARB15)，在NCBI中进行Blast搜索的结果；图3为SCARm2分子标记在四种不同材料中的扩增结果，泳道1为“中国春”，泳道 2为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系，泳道3为二倍体长穗偃麦草，泳道4为四倍体长穗偃麦草(Marker :DL2000)；图4为SCAI^2分子标记在“中国春”-长穗偃麦草IE 7E —套二体附加系中的定位结果，泳道1为“中国春”，泳道2为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系，泳道3为二倍体长穗偃麦草，泳道4为“中国春”-长穗偃麦草IE 二体附加系，泳道5为“中国春”-长穗偃麦草2E 二体附加系，泳道6为“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加系，泳道7为“中国春”-长穗偃麦草4E 二体附加系，泳道8为“中国春”-长穗偃麦草5E 二体附加系，泳道9 为“中国春”-长穗偃麦草6E 二体附加系，泳道10为“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系(Marker :DL2000)；图5为SCAR252分子标记在“中国春”-长穗偃麦草5E 二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂种后代Fp F2中的扩增结果，泳道1为普通小麦-“中国春”， 泳道2为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系，泳道3为二倍体长穗偃麦草，泳道4 13为“中国春”-长穗偃麦草5E 二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代材料，泳道14 M为F1代自交获得的F2代材料(Marker :DL2000)。
具体实施例方式本发明提供一种鉴定长穗偃麦草E组染色体的TRAP-SCARm2标记及其应用，通过 TRAP-SCAR法筛选获得特异性的TRAP片段，并转换为稳定的SCAR标记，并对其扩增进行了检测。下面结合具体的实施例对标记的制备、扩增和鉴定做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。所涉及的材料来源
“中国春”小麦来源于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点实验室， 2010年4月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点试验苗圃基地，2个月后提取DNA进行分子标记筛选试验。二倍体长穗偃麦草来源于日本国家生物资源计划小麦中心(http://WWW. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp) ,2010年1月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种温室，3个月后提取DNA，保存备用。四倍体长穗偃麦草来源于中国农科院，2010年1月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种温室，3个月后提取DNA，保存备用。“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系来源于日本国家生物资源计划小麦中心 (http//www. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp) ,2010 年 4 月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点试验苗圃基地，2个月后提取DNA进行分子标记筛选试验。1、TRAP分子标记方法筛选特异性TRAP片段利用TRAP分子标记方法，在普通小麦“中国春”、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草中进行多态性的筛选，获得特异性片段。1. 1采用CTAB法从新鲜的不同材料幼嫩叶片中分别提取基因组DNA，并检测DNA 浓度及质量；1. 2TRAP 片段扩增PCR 反应体系=DNA 模板 50ng, 10 X PCR buffer 2· 0 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM) 1. 5 μ 1， 任意引物(0. 3pmol)ly 1，固定引物(IOpmol) 1 μ l，r Taqpolymerase (5U/μ 1) 0· 2 μ 1，灭菌超纯水补足至20 μ 1 ；具体的PCR反应程序为
94 0C 94 0C 35 0C 72 0C
94 0C 50 0C 72 0C 72 0C
3 5 cycles
4 °Cforever该反应程序是最开始的5个循环在前，接着35个循环在后。在筛选的过程中，利用普通小麦“中国春”、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草三种材料对这168个引物组合进行筛选，筛选的依据是在普通小麦“中国春”与二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草两种材料中存在多态性，同时二倍体长穗偃麦草和四倍体长穗偃麦草两种材料又有同样大小的PCR产物，且PCR产物的片段大小要大于500bp，重复性好， 稳定且PCR产物的条带要清晰。TRAP片段扩增的14个正向引物来源于张娜(2009)，Li and Klindworth(2006)， 12个反向引物来源于张娜Q009)，Li and Quiros Q001)，引物均由上海生工公司合成， 正向引物和反向引物共有168个引物组合。从中筛选出特异引物对RGA-IlF ARBI5(SEQ. ID. NO. 1 和 SEQ. ID. NO. 2 所示)。1. 3取扩增产物各5 μ 1，均在含有lmg/ml EB的1. 2%琼脂糖中电泳检测，在紫外成像系统(Gel Doc-2000, Bio-Rad, USA)下观察并照相记录结果。1. 4构建载体并转化将琼脂糖电泳产物回收并纯化，然后将扩增的片段连接到pMDlS-T载体(明酶切位点为EcoR LHindIII)上，然后将连接后的载体转染JM109感受态细胞，接种于含有氨苄青霉素(50 μ g/ml)的LB固体培养基平板上，0. IM IPTG 4 μ 1禾口 20mg/ml的X_gal 40 μ 1 诱导，37°C培养箱过夜培养；挑取少量白斑菌落进行PCR扩增，同时将其在含有氨苄青霉素(50 μ g/ml)的LB 固体培养基平板上划线，扩大培养，37°C培养过夜；1.5挑去扩大培养后的细菌，提取DNA，然后进行PCR扩增，所用引物为通用引物即 RV-M, M13-47 (Kang, 2005)，其扩增体系如下94°C预变性 5min ；94°C变性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 60s，;35 个循环；72°C延伸 IOmin01. 6将扩增的片段进行测序，其核苷酸序列如SEQ. ID No. 3所示，在NCBI中将扩增的片段(称为 RGA-IlF ARBI5)进行 Blast 搜索，利用 PrimerPremier 5. 0 和 DNAMAN 5.0 等软件进行序列比对及分析，结果显示，发现它与小麦染色体3B特异BAC库中的272个碱基具有88%的同源性，其分析结果如图2所示，也可以将该片段称为长穗偃麦草E组染色体特异片段。该片段是来源于长穗偃麦草E组染色体的特异片段，它可以筛选含有长穗偃麦草 E组染色体的后代，该片段要求在小麦遗传背景下具有低同源性，其优势在于，它可以更加有效、准确地筛选小麦遗传背景下的含有长穗偃麦草E组染色体的后代，可以使后代筛选的过程更加简便、易行、可靠。2、将TRAP转化为SCAR标记根据设计SCAR引物的要求(1)引物长度范围18_2^ρ，通常是选择20_2^ρ ；⑵ 退火温度范围50 60°C，最好在52 58°C ； (3) GC含量范围40-55% ； (4)产物片段大小 400 800bp。利用Primer Premier 5. 0和DNAMAN 5. 0等软件进行TRAP片段特异SCAR引物设计，设计结果如下2C-F252 :tggaatgttg gacgaagg (SEQ. ID No. 4 所示)2C-R252 :cgcacgagca ttgttcta (SEQ. ID No. 5 所示)以该引物对进行PCR扩增的反应体系和反应程序分别为PCR 反应体系=DNA 模板 30ng, 10 X PCR buffer 2· 0 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM) 1. 5 μ 1， 上游引物(10 μ Μ) 1 μ 1，下游引物(10μΜ)1μ l,r Taq polymerase (5U/μ 1) 0· 2 μ 1，灭菌超纯水补足至20 μ 1 ；所述的PCR扩增的扩增程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s，M°C退火30s， 72°C延伸60s，30 35个循环；72°C延伸lOmin。所述PCR扩增产物片段大小为252bp，所以将其命名为SCAR252，具体的核苷酸序列如 SEQ. ID No. 6 所示。3、SCAR252分子标记验证3. 1长穗偃麦草特异SCAR252分子标记提取普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草材料的DNA，以其基因组为模板，采用2C-F252和2C-R252作为引物对扩增，再将其扩增产物进行凝胶电泳，进行了 SCAR标记验证，具体的检测结果如图3所示在二倍体长穗偃麦草(泳道幻、四倍体长穗偃麦草(泳道4)中扩增出了 252bp的片段，而在普通小麦“中国春”(泳道1)、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系(泳道2) 中没有该目的条带，初步证明此标记可以用于长穗偃麦草E组染色体的检测。3. 2长穗偃麦草特异SCAIi252分子标记定位利用“中国春”-长穗偃麦草IE 7E —套二体附加系对SCAR252分子标记进行定位，分别以IE 7E 二体附加系的基因组为模板，采用2C-F252和2C-R252作为引物对扩增，再将其扩增产物进行凝胶电泳，进行了 SCAR标记定位，具体的检测结果如图4所示其中泳道 3为阳性对照，可以看到该标记定位于“中国春”-长穗偃麦草5E(泳道8)、“中国春”-长穗偃麦草6E (泳道9)两个同祖群的染色体上。3. 3长穗偃麦草特异SCAIi252分子标记应用进一步利用SCARm2分子标记对“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系与“中国春”-长穗偃麦草5E 二体附加系的杂种F1代、F2代进行了分析，电泳结果如图5所示作为阴性对照的“中国春”没有扩增出目的片段，阳性对照二倍体长穗偃麦草扩增出目的片段，在全部F1代(泳道4 13)以及部分F2代材料中扩增出了目的片段，该 SCAR252标记的检测结果与材料基因组的特性相吻合，表现出检测的特异性；进一步证明了此SCAR252标记可以用来检测小麦背景下的长穗偃麦草E组染色体。因此该SCAR标记就可应用于小麦遗传背景下的长穗偃麦草5E或6E染色体鉴定或跟踪检测以SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物对待测基因组进行PCR扩增，然后根据扩增产物的电泳结果，对是否含有长穗偃麦草E组染色体进行判定若扩增产物的电泳结果当中含有252bp的目标片段，则待测基因组中含有长穗偃麦草E组染色体，而且为 5E或6E染色体；若扩增产物的电泳结果当中没有252bp的目标片段，则待测基因组中没有长穗偃麦草5E或6E染色体。该SCAR标记也为快速鉴定小麦遗传背景下的长穗偃麦草5E或6E染色质或染色体奠定了良好的基础，同时也为分子标记辅助育种提供了十分方便快捷的途径筛选标准即在普通小麦“中国春”背景下含有长穗偃麦草5E或6E染色质或染色体的后代。
权利要求
1.一种鉴定长穗偃麦草E组染色体的标记基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3 或 SEQ. ID. NO. 6 所示。
2.一种扩增SEQ. ID. NO. 3所示的标记的引物对，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2 所示。
3.一种扩增SEQ. ID. NO. 6所示的标记的引物对，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5 所示。
4.SEQ. ID. NO. 6所示的序列作为SCAR标记应用于小麦遗传背景下的长穗偃麦草5E或 6E染色体的鉴定或跟踪检测。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，应用于基于长穗偃麦草5E或6E染色体体系培育小麦品种的分子标记辅助育种。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的鉴定或跟踪检测是以SEQ.ID. NO. 4、 SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物对待测基因组进行PCR扩增，然后根据扩增产物的电泳结果，对是否含有长穗偃麦草5E或6E染色体进行判定。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增的程序为94°C预变性 5min ；94°C变性 30s, 54°C退火 30s, 72°C延伸 60s, 30 35 个循环；72°C延伸 IOmin0
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，若扩增产物的电泳结果当中含有252bp的目标片段，则待测基因组中含有长穗偃麦草5E或6E染色体；若扩增产物的电泳结果当中没有 252bp的目标片段，则待测基因组中没有长穗偃麦草5E或6E染色体。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定长穗偃麦草E组染色体的TRAP-SCAR252标记及其应用，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.6所示。通过TRAP-SCAR法筛选获得特异性的TRAP片段，并转换为稳定的SCAR标记，并对其扩增进行了检测。本发明提供的长穗偃麦草E组染色体的标记，通过SCAR标记的检测，为快速鉴定小麦遗传背景下的长穗偃麦草5E或6E染色质或染色体奠定了良好的基础，同时也为分子标记辅助育种提供了十分方便快捷的途径。
文档编号C12N15/11GK102443640SQ20111040445
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者徐国辉, 束永俊, 汪慧, 赵迪, 郭东林, 郭长虹 申请人:哈尔滨师范大学