一种茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂的制备与应用方法
【专利说明】一种茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂的制备与应用方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及的是植物繁殖促生剂，特别是一种茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂的制备与应用方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]茶叶是我国重要的经济作物，2012年种植面积达3170万亩，年产量162.3万吨，占全球37.8%，无论种植面积或产量都居世界第一。茶叶除了作为饮品外，开发茶叶有效成分并用于医药、食品、化工已成为新的发展方向。茶树是异花授粉作物，有性繁殖个体间经济性状杂，生长差异大，一般不能保持母本原有的特性。而茶树短穗扦插繁殖技术能保持母本的优良性状，具有繁殖系数大，方法简便，扦插后发根成苗快等优点，是目前生产上无性系茶树良种推广应用的主要繁育手段。
[0005]为提高茶树短穗扦插繁殖成活率，扦插繁殖时通常使用生根粉。生根粉的主要成分是化学合成的植物激素类物质萘乙酸钠和吲哚丁酸钾。萘乙酸钠促进不定根的形成，主要是主根的形成，但浓度过大可抑制生根；剛哚丁酸钾诱导作物形成不定根，主要是须根的形成，在强光下会缓慢分解。目前广泛使用的生根粉为ABT生根粉，已研宄开发出10种型号，1-5号为醇溶性，6-10号为水溶性。茶树短穗扦插繁殖则主要使用醇溶性的ABT I号和2号，即将健壮的茶树当年生枝条在ABT溶液(50mg.kg—1)浸泡半小时后扦插。生根粉具有成本低、促生根作用快的优点，但功效单一、不能有效促进茶苗后续生长发育且具有土壤残留风险的缺点。
[0006]茶树内生草螺菌是一种与山茶属植物共生专一性强的内生细菌，文献“两株茶树内生草螺菌的微生物学特性”(王婷等，微生物学报2014第4期，2014.04.04，P424-432)对茶树内生草螺菌的筛选和微生物学特性作了详细叙述。但对茶树内生草螺菌的应用没有涉及。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提出一种茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂的制备与应用方法。用该促生剂处理山茶属植物当年生枝条红梗或硬青梗，能有效促进扦插枝条生根长苗。
[0008]本发明是这样实现的。其步骤为 1、茶树内生草螺菌的筛选
先用清水冲洗干净无病害山茶树样本，再用75%酒精消毒0.5小时，随后用百分比浓度1%的汞溶液消毒3分钟。最后用无菌水冲洗3-5次。吸取最后一次冲洗材料的无菌水100 μ I，涂布牛肉膏蛋白胨培养基平板(3g牛肉膏、1g蛋白胨、5g NaCl、1.5%琼脂，加水至1000ml)上。37°C培养3天无菌落出现后，再将消毒处理的茶树叶片及组织切去边缘部分，将内部组织切小块放置于牛肉膏蛋白胨培养平板中，37°C培养48小时后获得内生菌菌落，随后进行菌落纯化与细菌分类学鉴定，最后获得茶树内生草螺菌。
[0009]、茶树内生草螺菌的培养及促生剂的制备
取-80 ° C保存的茶树内生草螺菌菌种，接种5mL LB液体培养基(1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，10 μ g/mL壮观霉素，加水至1000ml)，每分钟150转摇动，37 ° C培养过夜。将活化后的菌液以1:100比例接入新鲜的LB液体培养基或KB液体培养基(20 g胰蛋白胨、1.5 g K2HPO4U5 ml甘油、IM MgSO4,10 μ g/mL壮观霉素，加水至1000 ml)中放大培养，培养条件为摇床转速每分钟200转，温度为28- 37。C。待细菌培养8-10小时、0D_值为1.2-1.5时收集全部的细菌培养液，加入1%甘油后，存放于4 ° C备用或直接使用，上述细菌培养液即为本发明茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂。
[0010]所述促生剂的应用:
1、扦插技的处理:选择生长健壮的茶树当年生枝条作插条，插条长7-15厘米，顶部在侧芽上方平切，保留顶部1-2片叶，基部在侧芽下方平切。
[0011]2、用水将上述细菌培养液按0.5-1:1比例稀释并常温(8-38。C)浸泡扦插条
0.5-3小时。
[0012]3、然后在苗床进行扦插，扦插后按常规田间管理方法进行管理。
[0013]本发明的作用过程是这样的，茶树内生草螺菌是茶科植物的内生菌，仅通过创口进入茶树体内，细胞外共生。茶树扦插条上下平切后，茶树内生草螺菌在浸泡时可通过基部切口进入插条。扦插后一方面通过浸泡时培养液中的细菌代谢分泌物如IAA直接剌激扦插枝形成不定根，另一方面通过插条体内茶树内生草螺菌共生提供的细菌因子促进茶苗生长。茶树内生草螺菌是天然的茶树内生菌，无病害作用，通常仅在较老的枝条或叶片中定殖，新生的嫩枝嫩叶中无细菌，符合绿色环保和食品安全要求。
[0014]本发明具有独特的优点:
1、充分利用了茶树内生草螺菌的生物学特点。茶树内生草螺菌是山茶属植物专一性强的内生细菌，与茶树互惠共生无公害。它能有效地产生促进植物生长发育的iaa、nh4+、嗜铁载体和多酚氧化酶。IAA能剌激茶树细胞生长并诱导形成不定根，NH4+能为茶树提供氮源，嗜铁载体能为茶树吸附铁离子和提高茶树抗病能力，使用茶树内生草螺菌浸泡山茶属植物扦插条可实现细菌培养的代谢产物和细菌本身的综合利用，成本低、功能全、操作方便。
[0015]2、克服了目前生根粉功能单一、作用不持久、不能有效促进茶苗后续生长发育的缺点。茶树内生草螺菌培养液不仅能促进扦插枝的不定根形成，而且细菌进入插条后可持续发挥作用，促进茶苗的快速生长，并有望改善茶树的品质。
[0016]
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例3茶苗根、枝长势图片，
图2为本发明实施例4茶苗根、枝长势图片，
其中a、b、为茶树内生草螺菌培养液处理的，C、为清水处理作对照。
[0018]
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明进一步说明。
[0020]实施例1:
用清水冲洗干净无病害山茶树样本，再用75%酒精消毒0.5小时，随后用1%升汞消毒，3分钟。最后用无菌水冲洗3-5次。吸取最后一次冲洗材料的无菌水100 μ 1，涂布牛肉膏蛋白胨培养基平板(3g牛肉膏、1g蛋白胨、5g NaClU.5%琼脂，加水至1000ml)上。37°C培养3天无菌落出现后，再将消毒处理的茶树叶片及组织切去边缘部分，将内部组织切小块放置于牛肉膏蛋白胨培养平板中，37°C培养48小时后获得内生菌菌落。随后进行菌落纯化与细菌分类学鉴定，最后获得茶树内生草螺菌。
[0021]实施例2:
取-80。C保存的茶树内生草螺菌菌种，接种5mL LB液体培养基(1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，10 μ g/mL壮观霉素，加水至1000ml)，每分钟150转摇动，37 ° C培养过夜。将活化后的菌液以1:100比例接入新鲜的LB液体培养基或KB液体培养基(20 g胰蛋白胨、1.5 g K2HPO4U5 ml甘油、IM MgSO4,10 μ g/mL壮观霉素，加水至1000 ml)中放大培养，培养条件为摇床转速每分钟200转，温度为28-37。C。待细菌培养8-10小时、0D_值为1.2-1.5时收集全部的细菌培养液，加入1%甘油后即为促生剂。
[0022]实施例3:将0.5:1稀释的茶树内生草螺菌培养液处理京山I号硬青杆插条100根3小时，扦插后100%成活，5个月后的茶苗根须发达、新枝长势旺盛、叶片深绿，明显优于对照组(见图1)。
[0023]实施例4:将1:1稀释的茶树内生草螺菌培养液处理京山I号红杆插条100根I小时，扦插后100%成活，5个月后的茶苗根须发达、新枝长势良好、叶片深绿，明显优于对照组(见图2)。
【主权项】
1.一种茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂的制备，其特征在于其步骤为: I)、茶树内生草螺菌的筛选 用清水冲洗干净无病害山茶树样本，再用75%酒精消毒0.5小时，随后用百分比浓度1%的汞溶液消毒3分钟；最后用无菌水冲洗3-5次，吸取最后一次冲洗材料的无菌水100 μ 1，涂布牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37°C培养3天无菌落出现后，再将消毒处理的茶树叶片及组织切去边缘部分，将内部组织切小块放置于牛肉膏蛋白胨培养平板中，28-37?培养48小时后获得内生菌菌落；随后进行菌落纯化与细菌分类学鉴定，最后获得茶树内生草螺菌并-80°C保存； 所述牛肉膏蛋白胨培养基为3g牛肉膏、1g蛋白胨、5g NaCl、1.5%琼脂，加水至100ml ； 2 )、茶树内生草螺菌的培养及促生剂的制备 取-80 ° C保存的茶树内生草螺菌菌种，接种5mL LB液体培养基，每分钟150转摇动，37。C培养过夜；将活化后的菌液以1:100比例接入新鲜的LB液体培养基或KB液体培养基中放大培养，培养条件为摇床转速每分钟200转，温度为37 ° C ;待细菌培养8-10小时、OD6cJ直为1.2-1.5时收集全部的细菌培养液，加入1%甘油后，存放于4。C备用或直接使用，上述细菌培养液即为本发明茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂； 所述LB液体培养基为1g胰蛋白胨，5g酵母提取物，1g NaCl，加水至1000ml，1yg/mL壮观霉素； 所述KB液体培养基为20 g胰蛋白胨1.5 g K2HPO4U5 ml甘油、IM MgSO4,加水至1000ml，10 μ g/mL壮观霉素。
2.一种茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂的应用方法，其特征在于其步骤为: 1)、扦插技的处理，选择生长健壮的茶树当年生枝条作插条，插条长7-15厘米，顶部在侧芽上方平切，保留顶部1-2片叶，基部在侧芽下方平切； 2)、用水将上述细菌培养液按0.5-1:1比例稀释并于4-38。C温度浸泡扦插条0.5-3小时； 3)、然后在苗床进行扦插，扦插后按常规田间管理方法进行管理。
【专利摘要】本发明提出了一种茶树内生草螺菌扦插繁殖促生剂的制备与应用方法。它利用茶树内生草螺菌的生物学特点，用其发酵制备茶树内生草螺菌培养液，并按一定配比稀释后浸泡处理茶树扦插条。促生剂内细菌分泌的植物激素诱导扦插条形成不定根；促生剂内的细菌进入扦插条内共生并继续分泌代谢物，促进茶苗的快速生长。处理扦插后扦插条根系发达，成苗率高，茶苗生长旺盛，叶片深绿。本发明的技术方法成本低、操作简单、绿色安全、功效多、作用持久。该促生剂既可用于经济作物茶树的扦插繁殖也可用其它山茶属植物的扦插繁殖。
【IPC分类】A01P21-00, A01N63-00
【公开号】CN104585241
【申请号】CN201510015515
【发明人】王行国, 占桂婷, 李亚东, 饶辉福, 丁坤明
【申请人】湖北大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月13日