一种霍山石斛组织培养繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品领域，具体涉及一种霍山石斛组织培养繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 霍山石斛是我国濒临灭绝的珍稀物种，被誉为"中华仙草"之首，是霍山县独有的、 拥有原产地地理标志的名贵中药材，具有极高的药用保健价值，具有生津益明、清热养阴、 消炎止痛、清音明目功能及抗癌、抗衰老、抗辐射和增强免疫力等功效，尤其霍山石斛多糖 具有极高的保健和医疗作用。但由于其生境狭窄，繁殖困难，植株数量极少，因此人工种植 霍山霍山石斛具有广阔的前景，但缺乏优质种苗是霍山霍山石斛种植业的瓶颈之一。虽然 国内早有关于霍山霍山石斛种苗生产的专利和文献报道，但是却没有见到利用试管开花授 粉结果的方法来繁殖霍山霍山石斛的。
[0003] 由于野外的种种环境因素制约，受气候影响较大，且病虫害严重且难以防治，野生 的霍山石斛濒临灭绝，属于国家级珍惜名贵中药材，野外养殖繁殖率低，且成本较高。
[0004] 用霍山石斛种子培养出来的苗，一般称为实生苗，其特点是变异度比较大，植株形 状不太稳定，成本低，产量大，周期短。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种霍山石斛组织培养繁殖方法。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现： 一种霍山石斛组织培养繁殖方法，其特征在于包括以下内容： (1) 果荚选择：霍山石斛的花期在每年的四月中旬到五月中旬，这一段时期对霍山石斛 进行授粉，花授粉后，花梗下面会膨大，然后结果，等果实长到九月底，果荚就可采摘下来进 行播种繁殖，所述果荚选择原则：果实饱满，无病虫害，没有破裂的；在晴天中午或下午选 摘果荚，在雨天、阴天或露水未干时不宜采摘； (2) 外植体消毒：将霍山石斛果荚采回来后，先将果荚的首尾多余的部分用刀片去掉， 用75%的酒精棉擦拭果荚的表面及沟纹，将污垢和尘土擦拭干净后，把没有裂开果荚放到 消毒好的烧杯中，先放稀释10倍的次氯酸钠消毒液没过果荚，加一滴展着剂，充分摇荡，消 毒10分钟，再以无菌水冲洗三到四次，备用； (3) 接种培养：将备用好的果荚放入母液培养基中进行培养； (4) 继代培养：霍山石斛种子播种后7-14天，胚即吸水膨大，逐渐涨破种皮，形成淡黄 色的圆球体；30天后顶端分生组织突出，慢慢变绿，下半部有散射状的吸收毛分布；播种40 天，第一片拟叶形成，播种90天左右，由茎顶基部分化长出根；此时就可继代培养，转入继 代培养基中培养； (5) 壮苗培养：经过2-3个月的培养后，小苗长成具有2厘米长的茎时，再换入促进小 苗生长的壮苗培养基中，每瓶45-50株，在经过3-4个月的培养待新芽长到3-5厘米时就可 出瓶种植，霍山石斛从播种到出瓶种植约8-10个月； (6) 培养室管理：无菌培养室使用前一个星期，先把培养室的卫生打扫干净，用农药进 行熏蒸，关闭三天后开门通风，再用臭氧机消毒6小时，次天就可摆苗进去，培养室的温度 常年在24-26度，冷热都由空调控制，光照在1800-20001ux，有灯光控制，无菌培养室要时 刻保持干净卫生，定期打扫，消毒； (7) 不定芽诱导，增殖技术： T培养基的准备： 选择适合的培养基配方进行配置，调PH值在5. 4-5. 8之间，在121°C，内室压力在 0. 115MPa下灭菌20分钟，备用； f外植体的灭菌： 选择高为3-5厘米的健康植株，用刀片小心取出石斛的幼茎剥去外面节上的几张叶片 和包衣，放到洗涤剂中清洗，在清水清洗，放在10%次氯酸钠溶液中加两滴吐温20,清洗15 分钟，然后用蒸馏水冲洗3-4次； f接种： 把灭菌好的茎尖种在预先准备好的初始培养基上，一个试管接一个茎尖，培养30天左 右，存活的茎尖转接到其他的培养基中； I不定芽诱导： 取灭菌以后的茎尖接种到一诱导培养基中，进行诱导不定芽，培养50天左右； I不定芽增殖： 不定芽转接到增殖培养基中，培养2个月，倍数达到3倍以上继代培养； I原球茎诱导不定芽： 原球茎达到一定量后，可以转接到催芽培养基中催芽，生长2个月后，芽长到1厘米时 转接于生根培养基中； _：：生根培养： 苗生长到株高1厘米时，再将小苗转接到生根培养基中，进行生根培养，待株高涨到 3-5厘米，有5片以上叶，3-5条根时，就可移出瓶外种植。
[0007] 2.根据权利要求1所述的霍山石斛组织培养繁殖方法，其特征在于：培养基制 备： 母液和培养基的配制，在实验中常用的培养基，可将其中的各种成分配成10倍、100倍 的母液，放入冰箱中保存； a. 大量兀素混合母液：指浓度大于0. 5mmol/L的兀素，即含队？、1(、〇3、]\%、3六种 盐类的混合溶液，配成10倍母液，用时每配1000 ml取100mL母液，配时要注意以下几点： a.各化合物必须充分溶解后才能混合；b.混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根 离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀；c.混合时要慢，边 搅拌边混合； b. 微量元素混合母液：指小于0. 5mmol/L的元素即含除Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、 Cl盐类的混合溶液，因含量低，配成100倍甚至1000倍，用时每配1000ml取IOml或lml， 配时也要注意顺次溶解后再混合，以免沉淀； c. 铁盐母液：铁盐必须单独配制，若同其他无机元素混合配成母液，易造成沉淀，配法 是将5. 57gFeS04. 7H20水溶液缓慢加入到7. 45gNa2 -EDTA微沸水溶液中，并不断搅拌， 最后定容到1000ml，用时每配1000 ml培养基取5ml; d. 有机化合物母液：含有维生素和氨基酸类物质，分别配成单独的母液，其浓度有每 ml含 0? 1、1.OUOmg化合物； e.植物激素：每种激素必须单独配制成母液，浓度为每ml含0. 1、0. 5、I.Omg激素，配 法如下：IAAIBAGA3先溶与少量95%酒精，再加水定容到一定浓度；NAA溶于热水或少量 95%的酒精中，再加水定溶到一定浓度；2,4 一D不溶于水，用Imol的NaOH溶解后，再加水 定容至一定浓度；KIN和BA先溶于少量Imol的HCl中，再加水定容；玉米素先溶于少量 95 %酒精中，再加水至一定浓度， f. 培养基的配置 I混合培养基中的各成分。先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母 液、有机成分，然后加入植物激素及其他附加成分； +€溶化琼脂。称取应加的琼脂和蔗糖，将琼脂浸泡到透明后，用蒸馏水加热烧开熔化琼 月旨，待琼脂完全溶化后，把1加入，用pH试纸测pH值，并用0.Imol的NaOH或HCl调pH为 5. 6-5. 8; f分装到600ml的兰花瓶中，120ml/瓶； I在121 °C，压力在0. 1-0. 115MPa下灭菌20分钟，取出来放储藏室，备用。
[0008] 本发明的有益效果：能彻底改变了野生米斛结实率低的问题，同时解决野外的种 种环境因素制约，受气候影响较大，且病虫害严重且难以防治，保护了野生米斛，同时提高 了米斛繁殖率，保护了米斛的繁殖；用原球茎和不定芽培养出来的苗为克隆苗，其特点是能 保持亲本的优良特性，植株整齐一致，成本高，产量低，周期长，数代之后会退化，原球茎继 代要控制在6-8代，不定芽继代次数要控制在8-10代。
【具体实施方式】
[0009] -种霍山石斛组织培养繁殖方法，其特征在于包括以下内容： (1) 果荚选择：霍山石斛的花期在每年的四月中旬到五月中旬，这一段时期对霍山石斛 进行授粉，花授粉后，花梗下面会膨大，然后结果，等果实长到九月底，果荚就可采摘下来进 行播种繁殖，所述果荚选择原则：果实饱满，无病虫害，没有破裂的；在晴天中午或下午选 摘果荚，在雨天、阴天或露水未干时不宜采摘； (2) 外植体消毒：将霍山石斛果荚采回来后，先将果荚的首尾多余的部分用刀片去掉， 用75%的酒精棉擦拭果荚的表面及沟纹，将污垢和尘土擦拭干净后，把没有裂开果荚放到 消毒好的烧杯中，先放稀释10倍的次氯酸钠消毒液没过果荚，加一滴展着剂，充分摇荡，消 毒10分钟，再以无菌水冲洗三到四次，备用； (3) 接种培养：将备用好的果荚放入母液培养基中进行培养； (4) 继代培养：霍山石斛种子播种后10天，胚即吸水膨大，逐渐涨破种皮，形成淡黄色 的圆球体；30天后顶端分生组织突出，慢慢变绿，下半部有散射状的吸收毛分布；播种40 天，第一片拟叶形成，播种90天左右，由茎顶基部分化长出根；此时就可继代培养，转入继 代培养基中培养； (5) 壮苗培养：经过3个月的培养后，小苗长成具有2厘米长的茎时，再换入促进小苗 生长的壮苗培养基中，每瓶45株，在经过3个月的培养待新芽长到4厘米时就可出瓶种植， 霍山石斛从播种到出瓶种植约9个月； (6) 培养室管理：无菌培养室使用前一个星期，先把培养室的卫生打扫干净，用农药进 行熏蒸，关闭三天后开门通风，再用臭氧机消毒6小时，次天就可摆苗进去，培养室的温度 常年在25度，冷热都由空调控制，光照在20001uX，有灯光控制，无菌培养室要时刻保持干 净卫生，定期打扫，消毒； (7) 不定芽诱导，增殖技术： _；；培养基的准备： 选择适合的培养基配方进行配置，调PH值在5. 6之间，在121 °C，内室压力在0. 115MPa下灭菌20分钟，备用； S外植体的灭菌： 选择高为4厘米的健康植株，用刀片小心取出石斛的幼茎剥去外面节上的几张叶片和 包衣，放到洗涤剂中清洗，在清水清洗，放在10%次氯酸钠溶液中加两滴吐温20,清洗15分 钟，然后用蒸馏水冲洗3次； +f接种： 把灭菌好的茎尖种在预先准备好的初始培养基上，一个试管接一个茎尖，培养30天左 右，存活的茎尖转