黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗蔓枯病il14的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗蔓枯病IL14的筛选方法，通过不同浓度的批量处理，筛选出抗性表现良好的植株，属于生物技术育种领域。
【背景技术】
[0002]黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，主要分布于温带和亚热带地区。据联合国粮食与农业组织(FAO)统计，2010年中国黄瓜的栽培面积为988 680hm2，总产量达到40 710 200t，是世界上最大的黄瓜生产和消费国。近年来，随着设施黄瓜的不断发展，黄瓜蔓枯病(Mycosphaerella melonis)成为继根结线虫病后危害黄瓜生产的第二大病害。该病害在设施中遇高温高湿条件多发，黄瓜可减产20%左右，严重的将导致提前拉秧甚至绝收，这对黄瓜商品化生产造成严重影响(孙元超，2010 ;王培双和董勤成，2010)。
[0003]目前，国内国外尚无专门针对蔓枯病进行防治的有效措施，多数倾向于普通化学防治，化学药剂不但成本相对较高且在高温高湿等蔓枯病发病较为严重地区防治效果较差，不能有效的控制蔓枯病病情的发展，长期喷施化学药剂导致的环境污染及病原菌本身产生的抗药性日益明显，化学药剂在实际生产过程中的局限性日益突出；生物防治方面研宄较少且应用推广有限。因此筛选具有高抗稳定品种进行推广应用，可从根本上有效控制病情的发生和蔓延。
[0004]黄瓜遗传背景狭窄，变异率仅为3?8% (Staub et al.，1987)，抗病资源比较匮乏，自然条件下难以获得具有优良的抗病资源或突变体，因此黄瓜抗蔓枯病育种进程一度陷于瓶颈阶段。野生种或野生近缘种在长期进化过程中积累了抗逆遗传因子，为作物遗传改良提供了良好材料。通过远缘杂交转移近缘野生种中的优异抗性基因以拓展黄瓜遗传基础，利用远缘杂交获得渐渗系是拓宽植物遗传背景提高抗逆性的有效手段，渐渗系群体在挖掘、利用近缘种质资源，研宄影响作物生长发育、产量、抗逆性等复杂性状上发挥着重要作用，是解决黄瓜抗病、抗逆性育种进程中的重要方法和手段。
[0005]黄瓜野生种C.hystrix Chakr.(2n = 24)，是一个原产中国云南甜瓜属的珍稀野生种，经过多年多次抗性鉴定，明确该野生种对蔓枯病上具有多种抗性，如抗蔓枯病、霜霉病、根结线虫病等多种病害(Chen J F，1997;Chen J F，2003;Chen JF，2004)。陈劲楓等(Chen J F，2000)成功实现了其与感病栽培品种‘北京截头’(C.sativus L.，2n = 14)的种间杂交获得F1，利用胚胎拯救及体细胞无性系染色体加倍技术合成了新的异源四倍体Cucumis.Xhytivus0通过将该异源四倍体和栽培黄瓜‘北京截头’进行回交、自交，获得了一系列具有不同表型性状的渐渗育种材料。
[0006]远缘杂交不仅是创造新物种及新材料的有效途径，同时其渐渗到栽培作物中的外源有益基因可提高作物的抗病抗逆性，通过接种鉴定渐渗系群体对黄瓜蔓枯病的抗性，可筛选出对蔓枯病高抗的株系，从而改善栽培作物中黄瓜的商品化生产的质量，
【发明内容】
[0007]技术问题
[0008]本发明是针对当前现有技术的上述不足之处，提供一种抗蔓枯病黄瓜渐渗系材料的培育和筛选方法
[0009]技术方案
[0010]黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14的筛选方法，包含如下步骤:
[0011](I)黄瓜种间渐渗系的获得:以野生种酸黄瓜为母本，栽培黄瓜‘北京截头’为父本杂交获得杂种F1，野生种酸黄瓜可比栽培黄瓜‘北京截头’提前2个月播种，并对其进行40天以上的光周期处理，使两者花期相遇。杂种F1通过胚胎拯救结合体细胞无性系变异染色体加倍技术，获得可育的种间异源四倍体新种，命名为Cucumis hytivus，以异源四倍体新种Cucumis hytivus为母本，与栽培品种‘北京截头’通过系统回交和自交选育，获得86份携带有野生种染色体片段的黄瓜种间渐渗系材料。
[0012](2)黄瓜种间渐渗系抗蔓枯病接种初鉴定(春、秋两季):制备孢子浓度为IXlO6个/mL的蔓枯病病原菌孢子悬浮液，利用温室人工苗期接种鉴定方法喷施接种上述(I)中的86份黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料，接种7天后统计叶片病级。接种鉴定两季材料，共筛选出表现稳定的中抗及以上的渐渗系材料27份。
[0013](3)黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14筛选:制备孢子浓度为IX 17个/mL的蔓枯病病原菌孢子悬浮液，利用温室人工苗期接种鉴定方法喷施接种上述(2)中的27份黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料，接种7天后统计叶片病级。筛选出黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14o
[0014]所述的黄瓜种间渐渗系抗蔓枯病接种鉴定具体步骤如下:
[0015]I)接种前黄瓜材料的育苗和移苗步骤，具体方法如下:
[0016]育苗:将各株系黄瓜种间渐渗系于55°C温水中浸种3?5个小时，28°C恒温培养箱中催芽，每隔1h冲洗种子表面，更换浸种水，待种子胚根长至0.3?0.7cm时将种子播于装有灭菌营养土的穴盘中，置于温度25°C、相对湿度为80%的温室内。；
[0017]移苗:待黄瓜幼苗第一片真叶展平时移苗至装有灭菌营养土的营养钵(口径12cm，底径10cm，高8cm)中，每钵I株。
[0018]所述的灭菌营养土为草炭和蛭石1:1混合，并经121°C灭菌所得。
[0019]2)病原菌的获得与培养
[0020]病原菌的获得取子实体突出表皮的黄瓜蔓枯病蔓I?2cm，自来水冲洗2?3min，75%酒精表面消毒30s，无菌水清洗2?3min，用灭菌解剖针挑取单个子实体，置于盛有无菌水的灭菌培养皿中浸泡2min。将子实体放在含有利福平的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上进行培养(PH = 5)。培养皿放置在28°C下培养3d，通过多次分离培养，最终获得纯合培养(李英等，2007 ；Ellis and Holliday，1971)。
[0021]病原菌的培养将经纯化培养的病原菌采用挑取菌丝或孢子的方式，接种于含有利福平、PH为5.0的PDA培养基中，暗培养4d后采用暗培养和间歇紫外灯处理(12h黑暗/12h紫外灯)相结合的方法诱导分生孢子产生，25°C保存。
[0022]病原菌复壮:将经过纯化培养的病原菌接种于灭菌处理后的新鲜黄瓜表皮，4d后挑取黑色孢子接种于含有利福平的PDA培养基中(PH = 5.0)。
[0023]3)病原菌孢子悬浮液配置
[0024]加入5?1mL无菌水冲洗病原菌培养基表面，用L型玻璃棒轻轻刮培养基表层，获得的孢子悬浮液经四层纱布过滤，除去菌丝、琼脂等杂质的孢子粗提液作为母液。用乳酸调整孢子悬浮液的PH值至3.5?4.0，在显微镜下使用血球计数板统计悬浮液的孢子浓度，将接种孢子浓度配制至1Χ106πι?Λ接种前，加入2.5g.L—1的明胶作为表面活性剂。
[0025]4)接种
[0026]黄瓜幼苗生长至3?4片真叶时进行人工喷雾接种，接种孢子悬浮液浓度为I X 16Hir1，对照植株接种无菌水。接种后覆盖棚膜3d，遮光密闭小棚，并保持棚内相对湿度92%?95%，温度 21 ?25°C。
[0027]所述的接种步骤具体方法为待幼苗长到3?4片真叶时接种，使用喷雾器全株喷雾，控制喷施量至植株叶片上水滴欲滴，孢子悬浮液浓度为IX 16Hir1,接种后在密闭棚内放置加湿器进行加湿处理以保证湿度，对照组接种液不加病原菌分生孢子。保持棚内相对湿度92%?95%，温度21?25°C，进行正常肥水管理。
[0028]5)鉴定
[0029]接种后7d后统计叶部病级，统计部位为从茎基部起4片真叶，参照Wehner和Zhang的方法统计病级，按照如下公式计算病情指数。
[0030]病情指数(DI) =E (病级X该病级株数)/(最高病级X调查总株数)X 100。参考方中达(1998)的方法。叶，茎部病指DI ( 15为高抗(HR) ；15 < DI ^ 45为抗(R)；45 < DI ^ 75 为感⑶；75 < DI 为高感(HS)。
[0031]叶部分级标准:0?9级:0)无症状?2)零星感染；3?4)少量小斑点；5?6)20?50%的叶片有小斑点；7?8)植株萎蔫并且斑点超过50 % ;9)植株死亡(ffehner&Shetty, 2000)。
[0032]黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14的筛选通过以下方法获得的:
[0033](I)黄瓜-酸黄瓜渐渗系群体抗蔓枯病春秋两季初筛选:
[0034]以黄瓜-酸黄瓜渐渗系群体(86份)、普通栽培黄瓜‘北京截头’(感病对照)为材料，采用温室苗期人工接种鉴定的方法进行接种，制备孢子悬浮液浓度为I X 16个/mL。接种后覆盖棚膜3d，遮光密闭，保证棚内相对湿度92%?95%，温度21?25°C。接种I周后统计叶部病级，统计部位为从茎基部起4片真叶。根据公式得出病情指数在中抗以上的材料，两季共筛出27份。
[0035](2)黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14的筛选:
[0036]以(I)中所得27份黄瓜-酸黄瓜渐渗系为材料，普通栽培黄瓜‘北京截头’为感病对照，同样采用温室苗期人工接种鉴定的方法进行接种，制备孢子