发培养 基）：MS培养基上萌发频率为81 %。
[0149] 图7示出了在多年生黑麦草中人工种子的萌发和从人工种子衍生的幼苗的发育。
[0150] 图8示出了单独置于a)96孔板的孔中的多年生黑麦草的新鲜分离的由种子衍生 的胚，并将b)内生菌菌丝体悬浮液加至各个孔中并在c)生产用藻酸钙层包被的人工种子 之前使其在层流条件下部分风干。
[0151] 图9示出了由方法1生产的人工种子。
[0152] 图10示出了由方法1生产的萌发中的人工种子。
[0153] 图11示出了由方法2生产的人工种子。
[0154] 图12示出了由方法2生产的具有内生菌向外生长的人工种子。
[0155] 图13示出了由方法3生产的人工种子。
[0156] 图14示出了由方法3生产的具有内生菌向外生长的人工种子。
[0157] 图15示出了由方法3生产的萌发中的人工种子。
[0158] 图16示出了不同稀释率的内生菌悬浮液。
【具体实施方式】
[0159] 实施例1--大规模生产禾本科植物-内生菌共生体（人工种子）的方法
[0160] 本工作的目的是开发一种用于大规模生产禾本科植物内生菌共生体的有效、稳健 且低成本的方法。所述方法应该是：
[0161] a)适用于在100s-1000s禾本科植物基因型中接种IOs-IOOs内生菌；
[0162] b)适用于多年生黑麦草、高羊茅和臂形草属；和
[0163] c)适用于接种带有新产生的遗产变异[即，诱导突变（电离辐射、秋水仙碱）、定 向突变、异源转基因、同源转基因（cisgenesis)、内源转基因（intragenesis)等]的新型和 设计者内生菌（designerendophyte)。
[0164] 所述发明还应使得能够进行禾本科植物-内生菌共生体的下一世代从头开始的 分子育种、选择和评估[而不是对禾本科植物进行育种和接种，之后只进行内生菌接种和 共生体评估]。
[0165] 实施的实验策略 和相应的实验步骤 包括：
[0166] 1.大规模的由多年生黑麦草种子衍生的胚的分离和人工种子的生产
[0167] A.开发有效、低成本、大规模的种子表面消毒方法；
[0168] B.开发有效、低成本、大规模的由种子衍生的胚的分离方法；
[0169] C.开发有效、低成本、大规模的人工种子生产方法；
[0170] D.检测人工种子的萌发频率和萌发阶段；
[0171] E.评估衍生自人工种子的幼苗中的内生菌的存在，所述人工种子是由分离自含内 生菌的种子的胚产生；
[0172] 2.大规模将内生菌接种至多年生黑麦草人工种子
[0173]F.开发用于人工种子的有效、低成本、大规模的内生菌接种方法[基于使用内生 菌菌丝体接种种子衍生的胚，随后进行包括人工种子的双/多层包衣（内层含内生菌，外层 为"假-糊粉/胚乳"）的人工种子生产]
[0174] G.评估衍生自人工种子的幼苗中的内生菌的存在，所述人工种子是由被新型内生 菌接种的分离自不含内生菌的种子的胚产生。
[0175] 大规模的多年生黑麦草种子衍生的胚的分离和人工种子的生产
[0176] A)种子表面消毒方法
[0177] 所实施的种子表面消毒方法包括以下步骤：
[0178] 第一天：将种子在10%硫酸中浸泡过夜。
[0179] 第二天：用10%Domestos处理20分钟并用无菌蒸馏水洗涤后贮存于24°C。
[0180] 第三天：用10%Domestos处理20分钟并用无菌蒸馏水洗涤后储存于24°C，随后 进行胚分离[见下文B)]。
[0181] 每次用200粒种子进行4次独立实验。
[0182] 未观察到细菌或真菌污染。
[0183] B)胚分离方法
[0184] 基于成功的表面-种子消毒方法[见上文A)]，技术人员可在4小时内分离1000 粒黑麦草种子衍生的胚。
[0185] 人工种子生产方法
[0186] 将多年生黑麦草胚用藻酸钙包被成人工种子
[0187] i)用王盘添加的营养物的藻酸钙基质进行包被
[0188] 对于使用具有不含添加的营养物的藻酸钙基质的包衣将多年生黑麦草胚用藻酸 钙包被成人工种子，采取了以下步骤：
[0189] ?将胚新鲜分离并与3%藻酸钠溶液混合。
[0190] ?将藻酸盐液滴置于50mM氯化钙溶液中，同时以60rpm进行搅拌。每个液滴含有 一个胚。
[0191] 鲁搅拌15min后收集人工种子并用足量无菌蒸馏水洗涤。
[0192] 将人工种子置于萌发培养基MS或MS+lmg/LBAP上。
[0193] 图1示出了通过使用具有不含添加的营养物的藻酸钙基质的包衣将多年生黑麦 草胚进行藻酸钙包被而产生的人工种子。
[0194] ii)用含直添加的营养物的藻酸钙基质进行包被
[0195] 对于使用具有含有添加的营养物的藻酸钙基质的包衣将多年生黑麦草胚用藻酸 钙包被成人工种子，采取了以下步骤：
[0196] ?将胚新鲜分离并在改良MS培养基中与3%藻酸钠混合，所述改良MS培养基由 MS(不含CaCl2) +750mg/L谷氨酰胺 +5yMCuS04+l. 95g/LMES组成。
[0197] ?将藻酸盐液滴（含有单个胚）置于50mM氯化钙溶液，同时以60rpm进行搅拌。
[0198] 鲁每个液滴含有单个由种子衍生的分离的胚。
[0199] 鲁搅拌15min后收集人工种子并用无菌蒸馏水彻底洗涤。
[0200] ?将人工种子置于MS培养基平板上进行萌发。
[0201] iii)用有色的藻酸钙基质进行包被
[0202] 对于使用具有含有添加的营养物的有色藻酸钙基质的包衣将多年生黑麦草胚用 藻酸钙包被成人工种子，采取了以下步骤：
[0203] 将胚新鲜分离并在改良MS培养基中与3 %藻酸钠混合，所述改良MS培养基由 MS(不含CaCl2) +750mg/L谷氨酰胺 +5yMCuS04+l. 95g/LMES组成。
[0204] 将不同食品染料[即 10yL/mlQueenGreen(90610)或QueenPink(92330)]添 加至所述藻酸钠包衣溶液以对包衣基质进行着色，从而建立了证明多层包衣潜能的基础。
[0205] 将藻酸盐液滴（含有单个胚）置于50mM氯化钙溶液中，同时以60rpm进行搅拌。
[0206] 每个液滴含有单个由种子衍生的分离的胚。
[0207] 搅拌15min后收集人工种子并用无菌蒸馏水彻底洗涤。
[0208] 将人工种子置于MS培养基平板上进行萌发。
[0209] 图2示出了利用具有有色的藻酸钙基质的包衣将多年生黑麦草胚用藻酸钙包被 成人工种子。
[0210] iv)用多个藻酸钙基质层进行包被
[0211] 对于使用具有多个藻酸钙基质层的包衣将多年生黑麦草胚用藻酸钙包被成人工 种子，采取了以下步骤：
[0212] ?将胚新鲜分离并在改良MS培养基[由MS(不含CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5yM CuS04+1.95g/LMES组成]中与作为第一包衣层（层A)的3%藻酸钠混合以形成人工种子。
[0213] ?将藻酸盐液滴（含有单个胚）置于50mM氯化钙溶液中，同时以60rpm进行搅拌。 每个液滴含有单个由种子衍生的分离的胚。
[0214] 鲁搅拌15min后收集层A包被的人工种子并用无菌蒸馏水彻底洗涤。所述层A新 鲜包被的人工种子的平均直径为4_。将层A包被的人工种子置于有盖培养皿中并使其在 层流柜中风干1-2小时。所得风干的层A包被的人工种子的直径为2_。
[0215] ?将风干的层A包被的人工种子在改良MS培养基[由MS(不含CaCl2)+750mg/L 谷氨酰胺+5yMCuS04+1.95g/LMES组成]中与作为第二包衣层（层B)的用食品染料[即 lOyL/mlQueenGreen(90610)]着色的3%藻酸钠混合以形成双层包被的人工种子；进行 相同过程。
[0216] 图3示出了利用具有多个藻酸钙基质层的包衣将多年生黑麦草胚用藻酸钙包被 成人工种子。
[0217] 图4示出了利用具有多个藻酸钙基质层的包衣将多年生黑麦草胚用藻酸钙包被 成人工种子。
[0218] 将多年生黑麦草的新鲜分离的种子衍生的胚单独地置于a) 96-孔板或b) 384-孔 板的孔中。借助于一次性注射器，将藻酸钠溶液加入至各个孔中并将藻酸盐溶液中的单个 胚装载在注射器中。借助于该注射器，将藻酸盐溶液包被的单个胚在搅拌条件下滴在聚合 〇 &(：12溶液中以生产人工种子。优选使用96-孔板而非384-孔板生产多年生黑麦草人工种 子。
[0219] 评估人工种子的萌发频率
[0220] 为评估人工种子的萌发频率，采取了以下步骤：
[0221] 多年生黑麦草栽培变种BronsynE_(不含内生菌，2668种批）的种子、胚和人工种 子的萌发
[0222] 对如下的种子萌发频率进行了比较性评估（图5):
[0223] a)原始种子：在滤纸上萌发频率为1% ;
[0224] b)表面消毒的种子：在滤纸上萌发频率为10% ;
[0225] c)分离的胚：在萌发培养基上萌发频率为48% ;
[0226] d)人工种子（带有萌发培养基）：在MS培养基上萌发频率为40%。
[0227] 多年生黑麦草栽培变种BronsynE+(含内生菌，2667种批）的种子、胚和人工种子 的萌发
[0228] 对如下的种子萌发频率进行了比较性评估（图6):
[0229] a)原始种子：在滤纸上萌发频率为10% ;
[0230] b)表面消毒的种子：在滤纸上萌发频率为30% ;
[0231] c)分尚的胚：在萌发培养基上萌发频率为90% ;
[0232] d)人工种子（带有萌发培养基）：在MS培养基上萌发频率为81 %。
[0233] 图7示出了在多年生黑麦草中人工种子的萌发和由人工种子衍生的幼苗的发育。
[0234] 评估衍生自人工种子的幼苗中内生菌的存在
[0235] 为评估衍生自人工种子的幼苗中内生菌的存在，进行了以下实验：
[0236] 衍生自多年生黑麦草栽培变种BronsynE+(含内生菌，2667种批）的种子和人工 种子的幼苗中内生菌的存在
[0237] 将20株在滤纸上萌发的BronsynE+(2667)种子的幼苗转移到土壤中。
[0238] 将25株来自由BronsynE+(2667)种子衍生的胚产生的萌发的人工种子的幼苗转 移到土壤中。使用10%H2SO4过夜处理对人工种子中的胚进行消毒。
[0239] 在衍生自种子和人工种子的幼苗生长6周后，基于内生菌-特异性的SSR测试评 估内生菌的存在。
[0240] 将20株在滤纸上萌发的BronsynE+(2667 ;含ST内生菌）种子的幼苗转移到土壤 中，导致在内生菌特异性SSR测试中，19株幼苗中的13株（68% )的ST内生菌存在呈测试 阳性。
[0241] 将25株来自由BronsynE+(2667)种子衍生的胚产生的萌发的人工种子的幼苗转 移到土壤中。使用10%H2SO4S夜处理对人工种子中的胚进行消毒，导致在内生菌特异性 SSR测试中，23株幼苗中的19株（83% )的ST内生菌呈测试阳性，明确地表明用于种子表 面消毒、大规模胚分离和用藻酸钙包衣