一种石斛组培芽快速增殖的方法
【技术领域】
[0001]本发明专利涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种石斛组培芽快速增殖的方法。
【背景技术】
[0002]石斛组培芽是石斛由种胚分化成苗的中间形态，也是培育形成试管苗的关键环节。普通的培养条件下，石斛组培芽增殖分化速度缓慢，增殖效率低。目前常用添加激素的手段来促使组培芽的增殖分化，但是外源激素的添加，会随着植物的生长的进行，富集到植物机体内，对食用的安全性存在隐患。寻求安全有效的促进石斛组培芽快速增殖分化的方法对解决现有工厂规模化生产中石斛增殖与分化缓慢、激素残留等问题具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为了解决现有石斛组培芽增殖生产过程中遇到的生长增殖缓慢、外源激素使用、产品周期长等问题而提供的一种石斛组培芽快速增殖的方法，操作简单，成本较低廉。
[0004]实现上述目的的技术解决方案如下:
一种石斛组培芽快速增殖的方法，其特征在于按照下述步骤进行:
(O负离子水浸泡预处理:将石斛组培芽从培养瓶中取出，添加入负离子培养液至浸没，25°C条件下，浸泡4-8小时。
[0005](2)石斛组培芽的饥饿暗处理:将浸泡后的石斛组培芽取出，转入到去糖培养基中，25°C条件下，暗培养48-96小时。
[0006](3)石斛组培芽的增殖培养:从去糖培养基中取出石斛组培芽，转接入增殖培养基中，在温度25±2°C、50 μ mo I / (m2 *s)、每天光照14小时、光照强度1500-2000LX的条件下培养30-40天，该段时间内石斛组培芽可获得快速增殖。
[0007]所述的石斛为霍山石斛、铁皮石斛、铜皮石斛中的一种。
[0008]所述的石斛组培芽为霍山石斛、铁皮石斛或铜皮石斛种子在基本MS培养基上萌发的小芽。
[0009]步骤(I)中所述的负离子水中的负离子含量不低于200个/cm3。
[0010]步骤(2)中所述去糖培养基为去除蔗糖的液体MS培养基。
[0011]步骤(3)中的增殖培养基，为含30g/L蔗糖:麦芽糖比例为1:0.5?1:1.5的双糖固体MS培养基。
[0012]原理概述:
负离子是指外界条件下，原子外层电子摆脱原子核，从原子中释放出来，而逸出的自由电子会附着在某些分子或原子上，形成新的带负电荷的分子。通过电离部分水获得的负离子可以增加离子含量，促进植物对水分和营养物质的吸收，增强植物的物质运输功能，调节植物体的平衡渗透压。负离子形成过程中会释放部分氧气，增强根部的吸收作用，从而达到促进植物新陈代谢的作用。
[0013]短期的饥饿应激不会对机体产生损伤，反而会促使植物出现补偿生长现象。当胁迫解除后，植物的光合作用效率以及对营养元素吸收能力得到增加，生长速率可大幅度提尚O
[0014]与现有技术相比，本发明的方法具有如下有益效果:本发明通过短期的负离子处理产生萌动结合暗培养胁迫以促使石斛组培芽增强其新陈代谢活力，提高对光合反应的速率，达到同步、快速生长和增殖的目的。
[0015]1、本发明采用短期的负离子萌动结合暗培养胁迫和富营养培养方法取代了传统使用激素促使石斛组培芽增殖，避免了外源激素使用对人体健康的危害。
[0016]2、本发明采用短期的负离子萌动结合暗培养胁迫和富营养培养方法，显著提高了增殖率，30-40天石斛组培芽鲜重增殖率高达400%以上，芽的增殖率达110%以上，约是未处理对照组的4倍。增殖率=(处理后-处理前)/处理前X 100%。
[0017]3、本发明采用短期负离子萌动结合暗培养胁迫和富营养培养方法，操作简单，成本较低廉，为企业工厂化、规模化生产石斛提供了新的方法。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体的实施方式对本发明作进一步地说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但这些示例性的实施方式仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。
[0019]本专利中所涉及霍山石斛组培芽、铁皮石斛组培芽、铜皮石斛组培芽均为安徽康尔欣生物制药有限公司生产；MS培养基药品均为分析纯，均从普特朗生物科技有限公司购买；负离子水机购买于格豪电解水有限公司，负离子含量不低于200个/cm3。
[0020](I)负离子水浸泡预处理:将石斛组培芽从培养瓶中取出，添加入负离子培养液至浸没，25°C条件下，浸泡4-8小时。
[0021](2)石斛组培芽的饥饿暗处理:将浸泡后的石斛组培芽取出，转入到去糖培养基中，25°C条件下，暗培养48-96小时。
[0022](3)石斛组培芽的增殖培养:从暗培养取出的石斛组培芽，转接入增殖培养基中，在温度25±2°C、50 μπιο? / (m2 -s)、每天光照14小时、光照强度1500-2000LX的条件下培养30-40天，该段时间内石斛组培芽可获得快速增殖。以上涉及的组培芽转接操作均应在超净工作台内进行。
[0023]实施例1
一种霍山石斛组培芽快速增殖的方法，包括以下操作步骤:
步骤1:负离子水浸泡预处理
从培养瓶中取出霍山石斛组培芽20g，平均芽数32个/g，放入负离子含量不低于200个/cm3的负离子水200 mL中浸没，25°C条件下，浸泡处理4小时。
[0024]步骤2:霍山石斛组培芽的饥饿暗处理
将浸泡后的霍山石斛组培芽取出，转入到去糖MS培养基中，每瓶转接约4g，在温度25 ± 2 °C下，暗培养96小时。
[0025]步骤3:霍山石斛组培芽的增殖培养
从暗培养取出的霍山石斛组培芽，转接入含30g/L (鹿糖:麦芽糖比例为1:0.5)的双糖MS固体增殖培养基中，每瓶转接约4 g，在温度25±2°C、50 μ mo I / (m2.s)、每天光照14小时、、光照强度1500LX的条件下培养35天。35天后取出增殖的霍山石斛组培芽，每瓶重量平均为21.47 g，增重率为436.75%，出芽数平均可达77个/g，出芽率为140%。
[0026]实施例2
一种铁皮石斛组培芽快速增殖的方法，包括以下操作步骤:
步骤1:负离子水浸泡预处理
从培养瓶中取出铁皮石斛组培芽20g，平均芽数41个/g，放入负离子含量不低于200个/cm3的负离子水200 mL中浸没，25°C条件下，浸泡处理6 h。
[0027]步骤2:铁皮石斛组培芽的饥饿暗处理
将浸泡后的铁皮石斛组培芽取出，转入到去除蔗糖的液体MS培养基中，每瓶转接约4g，在温度25±2°C下，暗培养72 ho
[0028]步骤3:铁皮石斛组培芽的增殖培养
从暗培养取出的铁皮石斛组培芽，转接入含30 g/L (蔗糖:麦芽糖比例为1:1)的双糖MS固体增殖培养基中，每瓶转接约4g，在温度25±2°C、50 ymol / (m2 -s)、每天光照14小时、光照强度1800LX的条件下培养30天。30天后取出增殖的铁皮石斛组培芽，每瓶重量平均为22.12 g，增重率为453.00%，芽数平均可达87个/g，出芽率为112.20%。
[0029]实施例3
一种铜皮石斛组培芽快速增殖的方法，包括以下操作步骤:
步骤1:负离子水浸泡预处理
从培养瓶中取出铜皮石斛组培芽20g，平均芽数38个/g，放入负离子含量不低于200个/cm3的负离子水200 mL中浸没，25°C条件下，浸泡处理4 h。
[0030]步骤2:铜皮石斛组培芽的饥饿暗处理
将浸泡后的铜皮石斛组培芽取出，转入到去糖MS培养基中，每瓶转接约4 g，在温度25±2°C下，暗培养48 ho
[0031]步骤3:铜皮石斛组培芽的增殖培养
从暗培养取出的铜皮石斛组培芽，转接入含30g/L (蔗糖:麦芽糖比例为1:1.5)的双糖MS固体增殖培养基中，每瓶转接约4 g，在温度25±2°C、50 ymol / (m2.s)、每天光照14小时、光照强度2000LX的条件下培养30天。30天后取出增殖的铜皮石斛组培芽，每瓶重量平均为20.37g,增重率为409.25%，芽数平均可达82个/g，出芽率为115.79%。
【主权项】
1.一种石斛组培芽快速增殖的方法，其特征在于按照下述步骤进行: (1)负离子水浸泡预处理:将石斛组培芽从培养瓶中取出，添加入负离子培养液至浸没，25°C条件下，浸泡4-8小时； (2)石斛组培芽的饥饿暗处理:将浸泡后的石斛组培芽取出，转入到去糖培养基中，25°C条件下，暗培养48-96小时； (3)石斛组培芽的增殖培养:从去糖培养基中取出石斛组培芽，转接入增殖培养基中，在温度25±2°C、50 μπιο? / (m2 -s)、每天光照14小时、光照强度1500-2000LX的条件下培养30-40天，该段时间内石斛组培芽可获得快速增殖。
2.根据权利要求1所述的一种石斛组培芽快速增殖的方法，其特征在于所述的石斛为霍山石斛、铁皮石斛、铜皮石斛中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种石斛组培芽快速增殖的方法，其特征在于所述的石斛组培芽为霍山石斛、铁皮石斛或铜皮石斛种子在基本MS培养基上萌发的小芽。
4.根据权利要求1所述的一种石斛组培芽快速增殖的方法，其特征在于步骤(I)中所述的负离子水中的负离子含量不低于200个/cm3。
5.根据权利要求1所述的一种石斛组培芽快速增殖的方法，其特征在于步骤(2)中所述去糖培养基为去除蔗糖的液体MS培养基。
6.根据权利要求1所述的一种石斛组培芽快速增殖的方法，其特征在于步骤(3)中的增殖培养基，为含30g/L蔗糖:麦芽糖比例为1:0.5?1:1.5的双糖固体MS培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种石斛组培芽快速增殖的方法，该方法采用负离子水对石斛组培芽进行短期浸泡刺激，接着在无糖培养基中暗培养饥饿处理，最后转接到富营养培养基中，恢复光照条件，促使石斛组培芽快速增殖，具体包括以下操作步骤：（1）负离子水浸泡预处理；（2）石斛组培芽的饥饿暗处理；（3）石斛组培芽的增殖培养。本发明通过短期负离子水结合暗培养饥饿胁迫处理、后期富营养培养，促使石斛组培芽快速增殖。该方法简单易行，成本低廉，且石斛组培芽增殖效率高，适用于工厂化大规模生产。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104823853
【申请号】CN201510234922
【发明人】李德文, 梁泽然
【申请人】安徽康尔欣生物制药有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月11日