一种促进土沉香离体芽生芽的快速增殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种促进土沉香离体芽生芽快速增殖的 方法。
【背景技术】
[0002] 土沉香（Aquilaria sinensis (Lour. )Gilg)，又称白木香，是瑞香科 (Thymelaeaceae)沉香属（Aquilaria Lam)多年生热带和亚热带常绿乔木。主要分布于我 国广东、广西、福建、海南、台湾等地。土沉香是我国特有而珍贵的药用植物和香料植物，还 是很好的园林绿化树种。不过目前，由于沉香树生存环境的破坏、虫害及人为掠夺式砍伐等 原因，使野生土沉香资源遭到严重的破坏，现仅有零星散生的残存植株。1987年沉香树被列 为国家珍稀濒危三级保护植物，1999年被国务院批准为国家二级重点保护野生植物。目前 野生土沉香结实率低，不易获得大量优质种子且种子易丧失活力，通过常规的种子繁殖不 能满足生产的实际需求，所以离体培养快速繁殖可有效解决这一问题。
[0003] 目前采用芽生芽途径进行快速繁殖存在的主要问题是：外植体的诱导（以茎段或 种子为外植体）较为容易，但继代十分困难，常常出现严重的黄化、玻璃化和愈伤组织化， 不能实现有效的增殖。
[0004] 已有的研宄表明（徐强兴，吴妃华，周立赖.土沉香的组培快繁技术研宄[J]. 广东农业科学，2006,（8) :44-46.):离体培养条件下，土沉香芽生芽途径的继代增殖中对 激素浓度十分敏感。在仅采用BA和NAA配比的情况下，BA和NAA的适用浓度分别为0. 1~ 0. 2mg/L和0~0. 01mg/L，增殖率低，且出现普遍的愈伤组织化、玻璃化；或可以继代1~2 次（林超.白木香组织培养及多倍体诱导研宄[D].广州中医药大学，2013.)，但黄化现象 严重，无法实现持续的增殖。
[0005] 这也是现在市场上供应的苗木多由种子繁殖和扦插繁殖而来的原因。突破土沉香 的离体继代技术，可在短期内为市场提供大量优质的苗木，并为离体条件下多倍体诱导、辐 射育种等在内的各项育种工作提供技术基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种促进土沉香离体芽生芽的培养基；
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种促进土沉香离体芽生芽的快速增殖方法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是：
[0009] -种促进土沉香离体芽生芽的培养基，由以下三部分组成：
[0010] 1)初代培养基：在改良MS培养基的基础上添加25~35g/L蔗糖以及6.5~7. 5g/ L琼脂；
[0011] 2)促芽生芽培养基1 :在改良MS培养基的基础上添加0. 4~0. 6mg/L的BA、0. 8~ 1. 2mg/L 的 GA3、25 ~35g/L 蔗糖以及 6. 5 ~7. 5g/L 琼脂；
[0012] 3)促芽生芽培养基2 :在改良MS培养基的基础上添加0.5~1.0mg/L的BA、1.0~ 2. Omg/L 的 GA3、25 ~35g/L 蔗糖以及 6. 5 ~7. 5g/L 琼脂；
[0013] 其中改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基。
[0014] 进一步的，促芽生芽培养基1为在改良MS培养基的基础上添加0. 5mg/L的BA、 1. Omg/L的GA3、30g/L鹿糖以及7g/L琼脂。
[0015] 进一步的，促芽生芽培养基2为在改良MS培养基的基础上添加1.0mg/L的BA、 2. Omg/L的GA3、30g/L鹿糖以及7g/L琼脂。
[0016] -种促进土沉香离体芽生芽的快速增殖方法，包括以下步骤：
[0017] 1)选取健壮的土沉香母树，采摘成熟果实并选取饱满、粒大、无损伤的种子作为外 植体；
[0018] 2)在无菌条件下，对尚未裂开的果实进行表面消毒后，剥开果实、取出种子，去除 种皮，置于容器内，通过消毒综合处理后，接种在初代培养基上诱导无菌苗；
[0019] 3)将步骤2)中获得的无菌苗剪切为带不小于两个节的茎段，接种于促芽生芽培 养基1上进行初次继代培养；
[0020] 4)将步骤3)中获得的无菌苗剪切为带不小于两个节的茎段，接种于促芽生芽培 养基2上，可反复继代数次；
[0021] 其中初代培养基、促芽生芽培养基1和促芽生芽培养基2如上所述。
[0022] 作为上述快速增殖方法的进一步改进，步骤2)消毒综合处理过程包括加入70~ 75% v/v的酒精浸泡25~40s，无菌水清洗干净，再用质量百分比浓度为0. 08~0. 12 %的 升汞溶液浸泡8~lOmin，无菌水清洗6~8次，无菌滤纸吸干表面水分。
[0023] 作为上述快速增殖方法的进一步改进，步骤2)~4)中的培养条件均为：24~ 26°C、光照10~14h/d、光照强度2500~35001x。
[0024] 本发明的有益效果是：
[0025] 1.本发明首次加入赤霉素GA3配合BA进行继代增殖，解决了由于玻璃化、愈伤组 织化、黄化而导致的增殖率极低、不能持续继代增殖的问题；利用本发明的培养基可以促进 土沉香苗反复继代至少5次，从而获得数量可观的无菌土沉香苗；为进一步生根和移栽打 下良好的基础。
[0026] 2.促芽生芽培养基1中的BA和GA3的浓度低于促芽生芽培养基2,有助于茎段的 适应性生长。反复继代时，当促芽生芽培养基2中含有1. 0mg/L的BA、2. 0mg/L的GA3时， 对于茎段诱导芽生芽的效果最好，培养60天后，无菌苗从2个节的茎段长成带8~10个节 的植株，增殖倍数为4~5倍，植株高度约为8~10cm，增殖苗叶色深绿、生长健壮、叶柄处 带有芽点，符合生根和成苗要求。
[0027] 3.本发明的种子来源于成熟但未开裂的果实，污染少，无菌处理十分容易，污染率 接近为零。
[0028] 4.本发明种子来源于新鲜种子，种子活力高，将种胚接种在初代培养基上诱导种 子发芽，萌发率几乎为100% ;经过初次继代培养以及反复继代培养，每次继代可获得高达 4~5倍增殖倍数的健壮无菌苗，符合进一步的继代繁殖或生根移栽的需要。
【附图说明】
[0029] 图1为土沉香离体萌发的效果图；
[0030] 图2为离体继代5次后土沉香的效果图；
[0031] 图3为包含8~10个茎段的土沉香效果图。
【具体实施方式】
[0032] 英文缩略词如下：BA是6-苄基氨基嘌呤、IBA为吲哚丁酸，GA3为赤霉素。
[0033] 培养基的配制：
[0034] 本发明中的改良MS培养基为大量元素含量减半的MS培养基。
[0035] 改良MS培养基的组成成分如表1所示：
[0037] 配制1L改良MS培养基：准确称取表1中所述的各种化合物，加适量蒸馏水溶解， 用玻璃棒搅拌促溶，用NaOH调pH至6. 0,最后定容到1L。
[0038] 初代培养基的配制：在改良MS培养基的基础上添加25~35g/L蔗糖以及6. 5~ 7. 5g/L 琼脂。
[0039] 促芽生芽培养基1 :在改良MS培养基的基础上添加0. 4~0. 6mg/L的BA、0. 8~ 1. 2mg/L 的 GA3、25 ~35g/L 蔗糖以及 6. 5 ~7. 5g/L 琼脂；
[0040] 促芽生芽培养基2 :在改良MS培养基的基础上添加0. 5~1. Omg/L的BA、1. 0~ 2. Omg/L 的 GA3、25 ~35g/L 蔗糖以及 6. 5 ~7. 5g/L 琼脂；
[0041] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。如无特殊说明，以下 实施例中无菌苗的诱导以及继代培养条件均为24~26°C、光照12h/d、光照强度2500~ 35001x〇
[0042] 实施例1
[0043] 2014年7月从广东省深圳市羊台山公园采集外植体30个，经芽生芽途径离体培养 快速增殖，至2015年6月一共继代5次。具体步骤如下：
[0044] (1)果实的采摘和种子的准备：2014年7月10日，在广东省深圳市羊台山公园选 取健壮的土沉香母树，采摘成熟但未开裂的果实，当天拿回实验室，保存在4°C冰箱。一般来 说，土沉香种子不易保存，易丧失活力，所以一般控制在一周以内完成采集后的处理工作。 当然采集后尽快处理为佳。
[0045] (2)外植体无菌处理及无菌苗的诱导：2014年7月11日，在超净工作台上，用75% 酒精擦拭果实进行表面消毒，再剥开果实，取