迪庆野生型百脉根快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物繁殖技术领域，具体设及一种迪庆野生型百脉根快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 百脉根化orescomicula化SLinn.)又名五叶草（四叶草），在我国云南、四川、贵 少H、甘肃、湖北等地均有分布。云南发展畜牧业需要大量的豆科牧草，从1983年开始大规模 的豆科牧草引种，从中筛选出21个品种，虽在各地生长良好，但都未能在生产中大面积推 广应用。迪庆野生型百脉根广布于滨西海拔1400~3400m的山地、林隙地、轮歇地，是天然 草地中的重要豆科牧草。迪庆野生型百脉根耐热、耐旱、耐酸侣，其枝叶柔嫩、适口性好，各 种牲畜喜食，刈牧兼用。迪庆野生型百脉根不仅是优良牧草，而且是优良的水±保持植物、 蜜源植物和观赏植物，在云南极具开发利用价值。
[0003] 百脉根的细胞再生性在豆科牧草中是最好的，通过胚状体途径和不定芽途径均可 得到高频率的再生植株；遗传转化效率相对较高，且转基因植株生长速度快。因此，百脉根 是研究外源基因转化、生物固氮机理、牧草品质改良的豆科模式植物，也是作为生物反应器 进行动物疫苗生产的材料。但是在引种栽培实践中，发现由于百脉根的生活史一直是沿用 种子繁殖，苗期生长缓慢，抗逆性差，种子硬实率高，受±壤、溫度、季节等诸多因素制约，发 芽率偏低，在一定程度上影响了百脉根规模化种植。所W，在常规育种的基础上，利用生物 技术对其加W遗传改良，W培育出优质、高产的新品种，对扩大迪庆野生型百脉根生产和我 省未来草业的发展具有深远意义。目前还未对迪庆野生型百脉根进行生产化的大规模繁 殖，在当地主要W种子成熟落地萌发的方式进行繁殖，未见其种子无菌萌发和组织培养的 报道。
【发明内容】
[0004] 本发明为了解决迪庆野生型百脉根繁殖系数低、幼苗生长慢的问题，提供了一种 迪庆野生型百脉根快速繁殖方法。
[0005] 本发明采用如下技术方案：一种迪庆野生型百脉根快速繁殖方法，包括W下步 骤：
[0006] 1)MS培养基的制备、灭菌：每升培养基中包括母液药品：大量元素50ml(硝酸钟 KN03、硝酸锭NH4NO3、憐酸二氨钟皿2?〇4、硫酸儀MgS〇4? 7&0、氯化巧化化? 2&0)，微量元素 5ml(舰化钟KI、棚酸 &6〇3、硫酸儘MnS〇4? 4&0、硫酸锋ZnS〇4? 7&0、钢酸钢NazMcA? 2&0、 硫酸铜化S〇4? 5&0、氯化钻C0CI2? 6&0)，有机元素5ml(肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素VBi、盐 酸化唉醇VBe、烟酸VP巧，铁盐5ml(乙二胺四乙酸二钢胞2.邸TA、硫酸亚铁化S〇4? 7&0)。 薦糖30g、肌醇0.Ig、琼脂粉8g，抑为5.8;培养基的制备：取400ml左右的自来水倒入小 侣锅中加热，水开后，放入8g琼脂粉，边加热边揽拌，注意防止糊底，旺火煮开，再用文火加 热，直至琼脂全部融化即清澈见底为好，25min后关火，加入30g薦糖，0.Ig肌醇及量取好的 母液药品（NH4NO3l65〇mg/L;KN03igOOmg/L;CaCl2?甜2〇 440mg/L;M拆〇4? 7&037〇mg/L; KH2PO4170mg/L ;KI 0. 83mg/L ;&8〇36. 2mg/L ;MnS〇4? 4&0 22. 3mg/L ;ZnS〇4? 7&08.6mg/ L ;CuS〇4? 5&0 0. 025mg/L ;CoCl2?6H2O 0. 025mg/L ;化2M0O4? 2&0 0. 25mg/L ;FeS〇4? 7&0 27.8mg/L ;胞2邸TA37. 3mg/L ;肌醇lOOmg/L ;烟酸0. 5mg/L ;盐酸化唉醇0. 5mg/L;盐酸硫胺 素0.1 mg/L ;甘氨酸2mg/L)，揽拌5min，倒入1000ml的定容烧杯中定容，使用PH计测量培 养基的PH，需要调整时使用0. 1 %的化0H或肥1溶液调成抑值5.8,使用高压灭菌锅，保压 灭菌30min ;
[0007]。消毒百脉根种子、无菌接种：将迪庆野生型百脉根种子放入纱布中，用98%浓 硫酸浸泡（优选浸泡20min)，取出放入蒸馈水中清洗Imin，至少换水3次；接着用70%~ 75%酒精消毒30s，取出放入蒸馈水中清洗Imin，至少换水3次；最后用0. 1 %氯化隶（升 隶）灭菌（优选灭菌lOmin)后用蒸馈水冲洗5~6次，置于培养皿中，然后接种于无激素 的MS培养基上，每瓶接种10粒种子，重复10次；在药液消毒的过程中，轻轻摇晃装有种子 的容器，使药液和种子充分接触；将接种的种子放入培养室内，培养溫度为25 ± 2°C，光照 强度为1500-2000LUX，光照lOh/d;接种后每天观察1次，14天时统计种子的萌发率。
[0008] 3)愈伤组织的诱导：当14d时种子萌发后两片子叶展开，取其下胚轴，切成0.5cm 长的切段，接种于含2, 4-D化4-二氯苯氧乙酸）2-8mg/L(优选8mg/L)、KT(激动素）l-5mg/ L(优选3mg/L)，pH= 5.8的MS培养基上，每个处理组合重复S次；
[0009] 4)芽的诱导分化：诱导芽分化的激素浓度组合培养基为：含NAA(糞乙 酸）0. 5-1.Omg/L(优选Img/L)、6-BA(6-节氨基腺嚷岭）0. 5-2.Omg/L(优选 2mg/L)的MS 培养基，继代2~4次的愈伤组织接入培养基后18-32d观察芽长；
[0010] 5)根的诱导：当诱导出的芽长至5-8cm时，将不定芽切为1.0cm小茎段，每个小 茎段上至少有一个节间，把小茎段下端插入含有0. 05-0. 15mg/LNAA(优选0.1 mg/L)和 0. 1-lg/L碳粉（优选1. Og/L)的1/2MS培养基中生根。
[0011] 发明的有益效果及优点：本发明相对于现有技术中迪庆野生型百脉根的繁殖方 法，扩繁时间短、繁殖系数大。本发明可W提高迪庆野生型百脉根的繁殖系数、缩短繁殖周 期。
【附图说明】
[0012] 图1.本发明的迪庆野生型百脉根种子无菌萌发图；
[0013] 图2.本发明的迪庆野生型百脉根种子愈伤组织的诱导图；
[0014] 图3.本发明的迪庆野生型百脉根芽的分化图；
[0015] 图4.本发明的迪庆野生型百脉根生根诱导图。
【具体实施方式】[001引 实施例1
[0017] 1)培养基的配制：选用MS培养基（每升培养基中包括：大量元素50ml，微量元素 5ml，有机元素5ml，铁盐5ml，糖30g，肌醇0.Ig，琼脂粉8g)PH为5.8，具体如下：取400ml左 右的自来水倒入小侣锅中加热，水开后，放入8g琼脂粉，边加热边揽拌，注意防止糊底，旺 火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化即清澈见底为好，25min后关火，加入30g薦糖， 0.Ig肌醇及量取好的母液药品，揽拌5min。倒入1000ml的定容烧杯中定容。使用PH计测 量培养基的PH，需要调整时使用0. 1 %的化OH或肥1溶液调成5.8抑值左右即可。调整PH后注意一定要揽拌均匀，并且注意不能使用放置时间太久的酸或碱溶液。
[001引所述母液药品：大量元素50ml:硝酸钟KN03、硝酸锭NH4NO3、憐酸二氨钟KH2PO4、 硫酸儀MgS04?%0、氯化巧化化?2&0);微量元素5ml:舰化钟KI、棚酸蝴03、硫酸 车孟MnS04?4&0、硫酸锋ZnS04?7&0、钢酸钢NazMcA?2&0、硫酸铜CuS04?5&0、氯化钻 C0CI2?6&0:有机元素5ml:肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素VBi、盐酸化唉醇VBe、烟酸VPP;铁 盐5ml :乙二胺四乙酸二钢胞2.邸TA、硫酸亚铁FeS04?7&0。其中，NH4NO31650mg/L ;KN03 1900mg/L ;CaCl2?2&0 440mg/L ;M拆O4?7&0 370mg/L ;皿2口04170mg/L ;KI0. 83mg/L化803 6. 2mg/L ;MnS04.4&0 22. 3mg/L ;ZnS04.7&08.6mg/L ;CuS04.5&0 0. 025mg/L ;CoCl2.6&0 0. 025mg/L ;Na2Mo04?2&0 0. 25mg/L ;FeS04?7&0 27.8mg/L ;胞2邸TA 37. 3mg/L ;肌醇 lOOmg/L ;烟酸0. 5mg/L ;盐酸[I比唉醇0. 5mg/L ;盐酸硫胺素0.1 mg/L ;甘氨酸2mg/L。
[0019] 培养基的分装：培养基熬制后要趁热分装，1000ml培养基分装30瓶，每一瓶的量 尽量相同，不能太多也不能太少。分装时注意不要把培养基倒到瓶口壁上，避免日后污染， 必要时边揽拌边分装。封装用瓶盖梓紧，用防水记录笔写上培养基种类，准备灭菌。
[0020] 培养基的灭菌：使用高压灭菌锅，打开锅盖，提起锅筒，加水至水位线（不能干烧 灭菌锅，会发生危险）。把装好培养基的罐头瓶和接种用具等放人锅筒内，盖上锅盖，对角 旋紧螺丝，接通电源加热，当升至0.OSMI^a时，关电源开关，打开放气阀放气回"0"后关闭放 气阀，再打开电源开关。当气压上升到0. 时，保压灭菌30min，到时关闭电源开关，打 开气阀，当气压回"0"后打开锅盖，取出培养基，置于篮子备用（放置时尽量平衡，避免培养 基凝固后成斜坡状），把篮子放置阴凉干净的地方，灭菌好的培养基放置时间不能超过1个 月。
[002。。消毒百脉根种子、无菌接种：将迪庆野生型百脉根种子放入纱布中，用98%浓 硫酸浸泡20min，取出放入蒸馈水中清洗Imin，至少换水3次；接着用70%~75%酒精消毒 30s，取出放入蒸馈水中清洗Imin，至少换水3次；最后用0. 1 %氯化隶（升隶）灭菌lOmin 后用蒸馈水冲洗5~6次，置于培养皿中，然后接种于无激素的MS培养基上，每瓶接种10 粒种子，重复10次；在药液消毒的过程中，轻轻摇晃装有种子的容器，使药液和种子充分接 触；将接种的种子放入培养室内，培养溫度为25 ± 2°C，光照强度为1500-2000LUX，光照 lOh/d;接种后每天观察1次，14天时统计种子的萌发率。
[002引扣愈伤组织的诱导：当14d时种子萌发后两片子叶展开，取其下胚轴，切成0. 5cm长的切段，接种于含2, 4-D化4-二氯苯氧乙酸）8mg/L、KT(激动素）3mg/L，抑=5.8的MS 培养基上，每个处理组合重复=次；
[0023] 4)芽的诱导分化：诱导芽分化的激素浓度组合培养基为：含NAA(糞乙酸）Img/l、 6-BA(6-节氨基腺嚷岭）2mg/L的MS培养基，继代2~4次的愈伤组织接入培养基后18-32d 观察芽长；
[0024] 5)根的诱导：当诱导出的芽长至5-8cm时，将不定芽切为1.0cm小茎段，每个小茎 段上至少有一个节间，把小茎段下端插入含有0.Img/LNAA和Ig/L碳粉的1/2MS培养基中 生根。
[00幼 实施例2
[002引步骤1)、步骤。同实施例1