一种利用ghrelin促进新生雏鸡生长性能的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及提高新生雏鸡生长性能的方法，具体涉及一种利用ghrelin促进新生 雏鸡生长性能的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 肌肉是人类主要的食用产品，对于现代养禽业者来讲，获得最大的生产效益即是 促进胴体的发育，尤其是胸肌和腿肌的产量，已有研究证明禽类肌纤维数目在出生前就已 确定，出生后不会出现随着日龄的增加肌纤维数目增加的现象。因此，出生后肌纤维的生 长发育主要是其直径的肥大、肌节的延长和肌纤维类型转变引起的。禽类出生后肌肉的生 长发育主要表现为肌纤维面积的增加，形态上呈现出肌纤维肥大的变化。由于雏鸡出壳 时的体重可作为市场出售时鸡重的一个重要指标，比如雏鸡出生时每增加lg，出售时增加 8_13g，因而有学者开始研究多种方法来提高雏鸡出壳时肌纤维的数量、提高出壳时雏鸡的 体重，比如胚胎期使用单色绿光照明。雏鸡的培育效果对育成鸡的生长发育和将来生产性 能的发挥有极其重要的影响，现有技术中主要通过雏鸡出壳后的一系列方法来提高雏鸡的 生产性能，例如，通过温度、消毒与防疫、饲养管理等方面入手。但是该类方法对于提高雏鸡 的生产性能有一定的局限性，雏鸡的很多体质在出壳后已经确定，很难进行优化。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种利用ghrelin促进新生雏鸡生长性 能的方法及应用。
[0004] 本发明的技术方案是：一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，具体是 通过在受精蛋开始孵化的第五天至第十五天之间向卵白内注射至少一次ghrelin溶液。[0005] 本发明的进一步改进包括：
[0006] 所述ghrelin溶液的浓度为100-150ng/ul，每次每蛋注射量为0· 1ml。
[0007] 在受精蛋开始孵化的第五天和第十五天时，分别向卵白内注射一次ghrelin溶 液。
[0008] 在受精蛋开始孵化的第五天时，每枚蛋注射浓度为100ng/ul的ghrelin溶液 0. 1ml〇
[0009] 在受精蛋开始孵化的第五天时，每枚蛋注射浓度为150ng/ul的ghrelin溶液 0. 1ml〇
[0010] 在受精蛋开始孵化的第十五天时，每枚蛋注射浓度为100ng/ul的ghrelin溶液 0. 1ml〇
[0011] 在受精蛋开始孵化的第十五天时，每枚蛋注射浓度为150ng/ul的ghrelin溶液 0. 1ml〇
[0012] 本发明所述的ghrelin来源优选是鼠。
[0013] 本发明的另一目的在于，ghrelin在促进新生雏鸡生长性能中的应用。
[0014] 本发明实施方法简单，通过卵内饲喂，能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌肌 卫星细胞的增值能力和相对数量，能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和骨骼肌的质量，增加肌 纤维横截面积、促进肌纤维的分化能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌的肌纤维的横截 面积和质量。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做详细说明。
[0016]实验材料与方法
[0017] 1试验材料
[0018] 1.1实验动物
[0019] 选用Ross肉鸡受精种蛋（新乡大用有限公司）称重，挑取重量在65-70g的蛋140 枚，随机分成7组，每组20枚，分别为Control组（正常孵化倍，不做任何处理）、E5-100组、 E5-150组、E5-醋酸组、E15-100组、E15-150组、E15-醋酸组。对各组蛋进行编号，记录。 孵化条件：37. 5 ± 0. 2 °C，相对湿度55 ± 2 %。
[0020] 1. 2动物处理：卵内喂食ghrelin
[0021] Control组在整个孵化的过程中不做任何处理；
[0022] E5-100组在E5胚龄时每枚蛋注射浓度为100ng/ul的ghrelin溶液(λ1ml;
[0023]E5-150组在E5胚龄时每枚蛋注射浓度为150ng/ul的ghrelin溶液(λ1ml，
[0024]E5-醋酸组在E5胚龄时每枚蛋注射醋酸0· 1ml;
[0025]E15-100组在E15胚龄时每枚蛋注射浓度为100ng/ul ghrelin溶液0· 1ml，
[0026]E15-150组在E15胚龄时每枚蛋注射浓度为150ng/ulghrelin溶液0· 1ml。
[0027]El5-醋酸组在E5胚龄时每枚蛋注射醋酸0· 1ml ;
[0028]ghrelin溶液的配方：鼠ghrelin粉末，用浓度为0.1%醋酸稀释。
[0029] 卵内喂食的具体步骤：E5(开始孵化的第五天）胚龄时，通过照蛋器照蛋发现卵白 的位置在气室的正下方，E15胚龄时，通过照蛋器照蛋，发现卵白的位置在气室的斜下方，标 出注射位点。采用22G针头卵白注射ghrelin溶液，注射后，玻璃纸蜡封注射口，继续孵化， 此时，孵化器摇蛋按钮关闭，24小时后，蜡封的口凝固后，重新打开摇蛋按钮，继续孵化。
[0030] 1. 3组织取材
[0031] 雏鸡出壳后新生雏鸡称重，记录。按100mg/100g体质量乌拉坦麻醉，然后颈椎脱 臼处死，其中每组17只鸡取胸大肌、腓肠肌、用0. 75%的生理盐水冲洗干净，用滤纸吸去多 余的水分，再用万分之一的分析天平称重后置于4%的多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7. 4)中固 定。每组另外3只鸡取胸大肌和腓肠肌称重，用于肌卫星细胞的培养。
[0032] 2试验方法
[0033] 2. 1石蜡切片制作
[0034] 将固定好的胸大肌、腓肠肌等组织置于水龙头下，流水冲洗24小时后置于梯度 酒精脱水（50%酒精2h、60%酒精2h、70%酒精2h、80%酒精2h、90%酒精lh、100%酒精 I30min、100%酒精II30min)，再放入二甲苯：无水酒精（1:1)I、11各lh，最后置于二甲 苯中透明。透明后的组织顺次放入蜡I、蜡II各30min，最后放入蜡IIIlh，包埋组织，制作蜡 块。将组织蜡块切片机连续切片，厚度5μm，45 °C水浴展片，捞片，55 °C烤片机烤片，后置于 37 °C电热恒温干燥箱内24h备用。
[0035] 2. 2常规HE染色
[0036] (1)将脱蜡处理后的组织切片用蒸馏水洗涤干净；（2)苏木精溶液染色约lOmin; (3)用蒸馏水冲洗去多余的染液，0.5%盐酸乙醇溶液中l_3s(至镜检下细胞浆为无色时取 出）；（4)蒸馏水洗涤3次，每次约5min，后自来水蓝化20min;(5)依次浸入50 %乙醇溶液、 70%乙醇溶液、85 %乙醇溶液，每级l-2min;(6) 0. 5 %伊红乙醇溶液染色约2min;(7)依次 浸入95%乙醇、无水乙醇中脱水（每级l-3min) ; (8)二甲苯：无水乙醇（1:1) 3min; (9)二 甲苯透明处理lOmin，最后用中性树胶封片，封好后置于通风柜中瞭干。
[0037] 2. 3PCNA(细胞增核抗原）免疫组化
[0038]1.石蜡切片经二甲苯I、二甲苯II各脱蜡5min，浓度递减梯度酒精3min，最后置 蒸馏水中。
[0039] 2.于0. 01M的柠檬酸钠酸碱缓冲液中，微波修复（要求：调整火力使缓冲液温度 保持在92-95°C，时间持续15min，冷却至室温），暴露抗原。
[0040] 3. 0· 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[0041] 4. 3%双氧水（用甲醇和30%双氧水配制）处理，置于湿盒室温避光孵育30min， 封闭内源性的过氧化物酶。
[0042] 5. 0· 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[0043] 6. 5%的山羊血清（用0· 01PBS配制）处理，置于湿盒室温孵育30min，进一步抑制 假阳性表达。
[0044]7.不清洗，甩去多余液体，加PCNA单抗（小鼠抗人，用0· 01MPBS1:200倍稀释）， 每张片上选择1-2片组织作为阴性对照，阴性对照加等量的0. 01MPBS，4°C孵育过夜。
[0045] 8·室温恒温lh。
[0046] 9. 0· 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[0047] 10.加二抗（山羊抗小鼠IgG，用0.01MPBS1:100倍稀释），置于湿盒室温孵育2h。
[0048] 11. 0· 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[0049] 12.利用DAB显色试剂盒显色：lmL蒸馏水中，加入A试剂一滴，混匀，再依次加 入B、C各一滴，混匀。滴加至切片上，置于湿盒室温避光孵育，显微镜下观察，控制显色时 间（注意：在保证充分孵育的同时，又要防止背景颜色过深），显色完成后，用蒸馏水漂洗干 净。
[0050] 13.苏木素复染2min，蒸馏水漂洗，自来水流水蓝化5min。
[0051] 14.浓度递增梯度酒精脱水，梯度酒精3min，二甲苯I、II5min，中性树胶封片。
[0052] 15.结果判定：镜下PCNA免疫阳性细胞呈棕黄色或褐色。
[0053] 16.利用Olympus显微照相系统拍照，IPP(Image-ProPlussoftware6. 0)软件 测量PCNA表达的光密度值。
[0054] 2. 4肌卫星细胞的培养与增值能力的测定
[0055] 2. 4. 1肌卫星细胞的培养
[0056]按前述方法麻醉并处死雏鸡，在无菌条件下取胸