的测交植物与也对作为类萜 增加性状之基础的遗传信息纯合的待检验材料杂交。当待观察性状的分离在因杂交的F2中 时不存在时，则证明未知的遗传信息与如测交植物的基因组中所包含的一种或多种本发明 QTL等效或相同。优选地，测交植物对全部三种QTL均纯合。
[0138]保藏物
[0139] 包含QTLl的辣椒品系I IR. 6968-00的种子和包含QTL2和QTL3的辣椒品系 I IR. 6921-00的种子在2013年4月12日分别按照保藏登录号NCMB 42140和NCIMB 42138保 藏在NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,BucksburnjAberdeen AB219YA, 英国，所述QTL各自导致产生类萜总含量增加的果实的辣椒植物。保藏物NCMB 42140的种 子在LGl上以纯合态包含QTLl，而保藏物NCHMB 42138的种子在LG10.1上以纯合态包含QTL2 和QTL3。
[0140] 保藏的种子不符合获得植物品种保护所要求的DUS标准，因此不能视为植物品种。
[0141] 标记信息
[0142] 表1:SNP分子标记
[0143]
[0146] 标记SEQ ID No:l、SEQ ID No:3、SEQ ID No:5、SEQ ID No:7和SEQ ID No:9的SNP 序列在保藏物NCnffl 42140的种子的基因组中与本发明的QTLl连锁，并且标记SEQ ID No: 15、SEQ ID No:17、SEQ ID No:19、SEQ ID No:21、SEQ ID No:23和SEQ ID No:25的SNP序列 在保藏物NCIMB 42138的种子的基因组中与本发明的QTL2连锁。标记SEQ ID No :11和SEQ ID No: 13的SNP序列在保藏物NCIMB 42138的种子的基因组中与本发明的QTL3连锁，所述 QTL各自向辣椒植物的果实赋予增加的类萜总含量。这些SNP序列可以用作植物的果实的类 萜总含量增加的分子标记，所述植物从源自所述保藏物的种子培育。
[0147] SEQ ID No:2、SEQ ID No:4、SEQ ID No:6、SEQ ID No:8、SEQ ID N〇:10、SEQ ID No:12、SEQ ID No:14、SEQ ID No:16、SEQ ID No:18、SEQ ID N〇:20、SEQ ID No:22、SEQ ID No :24和SEQ ID No :26的序列分别代表分子SNP标记SEQ ID No :1、SEQ ID No :3、SEQ ID No:5、SEQ ID No:7、SEQ ID No:9、SEQ ID No:ll、SEQ ID No:13、SEQ ID No:15、SEQ ID No:17、SEQIDNo:19、SEQIDNo:21、SEQIDNo:23和SEQIDNo:25的野生型辣椒等位基 因。
[0148] 在标记和野生型辣椒之间差异的核苷酸加下划线。
【附图说明】
[0149] 本发明将在后续并且不意在限制本发明范围的实施例中进一步说明。在实施例中 参考以下图：
[0150] 图1:选择的本发明QTL的图示:A.LG1上的QTL1，B.LG10.1上的QTL2和C.LG10.1上 的QTL3。
[0151] 风铃椒种质渗入用它们的标记显示为B(纯合，大写），而辣椒基因组背景以A显示。
[0152] 图2:辣椒X风铃椒BC2群体连锁群I (LG1)和连锁群10.1 (LG10.1)的遗传图。
[0153] 图3:在不同辣椒种质的叶盘上5天期间由单只同步化雌性叶螨产下的卵的数目 (土标准误）。对于三个实验复制的每一个，N = 9。检验的辣椒种质是:辣椒回归亲本GNM、风 铃椒下垂变种种质PEN45;3种随机选择的不携带本发明任何QTL的NIL(NIL A、NIL B和NIL C);具有种质渗入1^1(0孔1)的祖1^36和[1^47和具有种质渗入1^10.1的[1^54(0孔2外加 QTL3) NIL48 (QTL2)和 NIL45。
[0154] 实施例
[0155] 实施例1开发类萜总含量增加的辣椒植物
[0156] 使用风铃椒下垂变种种质PEN45作为供体亲本与三个栽培型辣椒块状繁育系(MT、 SM和GNM)回交(BC)。因为难以种间杂交，生成一个由三个子群体组成的多亲本BC2群体用于 形成连锁图。选择三个子群体当中最大的PEN45BC2子群体连同其系谱中的块状亲本SM和 G匪以更详细地研究果实特征。在这个群体中，总计54株BC2植物中34株产生足量近交种子 以培育BC2S 1株系。在2009年，34个BC2S1株系在含有5-9株植物连同（如果可能）2个重复(对 于23个BC 2S1株系，是可能）的试验区中按随机区组设计培育。在荷兰De Lier的温室土壤中 培育植物，每株植物2根茎及2.5株植物s/m2。
[0157] 归因于材料的世代(BC2S1)和其系谱中存在两个不同繁育系（SM和G匪），各株系对 几种性状仍然分离。为了尽可能均匀地培育BC 2S1株系，用基于非辛辣植物的Punl基因座的 标记和用基于非红色（即黄色或橙色)植物的CCS基因（辣椒红素-辣椒玉红素合酶）的标记 预先选择植物。为了补偿针对Punl或CCS连锁的具备潜在有意义特征的PEN45片段选择，（34 个株系当中）5个和2个BC 2S1株系分别用来选择具有纯合辛辣橙果实和纯合非辛辣红色果实 的植物。这些植物也以2个重复在含有5株植物的试验田培育。基因型SM、GNM和PEN45作为对 照以4个重复培育。
[0158] 在首批果实成熟时，通过从试验区移除最异常(主要是不育）的植物，使得BC2S1试 验区在表型上更均匀。总计，25个BC 2S1株系对橙色呈均匀，其他9个株系对橙色或黄色果实 的植物分离。最终，250株队:^植物留在69个试验区（1-6株植物)并用于QTL作图，橙色果实 植物160株，黄色果实植物61株并且红色果实植物29株。
[0159] 通过一个世代与G匪回交，接着两个自交步骤，衍生自三种不同BC2植物的三种不 同BC2S1植物用来开发近等基因系(NIL) JIL群体由遗传同质的株系组成，这些株系彼此仅 因存在来自供体亲本的（不同）单一或仅有限数目的种质渗入片段而不同。在这种情况下， 供体亲本是种质PEN45,风铃椒亲本。
[0160]用分布于原始BC2S1种质渗入旁侧的SNP对每个世代（即回交步骤和自交步骤)进行 基因分型以获得在G匪遗传背景中具有有限数目种质渗入的株系。在2011年，将23个NIL和 回归亲本(G匪）以3个重复按每块试验区5株植物以完全随机化设置培育。在温室在与BC 2S1 株系相似的条件下，这次在秋季并在岩棉上培育植物。
[0161] 实施例2用于生物化学分析的辣椒果实采样
[0162] 来自第二批果实集合的成熟果实(95-100%着色）用于生物化学测量。收获后，将 果实储存在20°C及80%相对湿度的气候室中3-4天以优化成熟。这是模拟荷兰商业系统的 程序。将果实用冷的流动自来水洗涤，用干净毛巾擦干，切成(弃去顶部和底部）l_2cm小片， 将这些小片混合并移除种子。将一半来自每份样品的果实小片立即在液氮中冷冻，在电动 磨中研磨并贮存在_80°C用于稍后的生物化学分析。
[0163] 收获每个试验区的BC2S1植物的果实并且在试验区对具有橙色或黄色果实的植物 分离的情况下，分别堆起两种颜色的果实。56个BC2S1试验区（37个橙色、15个黄色和4个红 色)产生足量的果实以形成用于生物化学评价的含5-8枚果实的代表性果实样品。此外，32 份样品由仅产生用于生物化学评价的足够果实或产生辛辣果实的试验区植物和/或单独植 物组成。
[0164] 在NIL实验中，20株NIL和GNM产生足够果实并且按每个试验区成堆评价。
[0165] 实施例3代谢概况分析和QTL分析
[0166] BC2S1实验和NIL实验的生物化学概况分析如Eggink等人(Food Chemistry(2012) 132，301-310)中所述进行。在BC2S1实验中，分析了92份辣椒果实样品，在全部样品中有辣 椒亲本系GNM的果实样品和商业橙色块状辣椒杂交参考系Orange Glory的果实样品
[0167] 简而言之，使用顶空SPME-GC-MS进行挥发性代谢物的概况分析。通过MetAlignTM 软件包(http://www.metalign.nl)处理衍生的GC-MS曲线，用于基线修正、噪声估计和离子 级质谱比对。多变量质谱重建(MMSR)法(Tikunov等人，Metabolomics(2012)8,714-718)用 来将数据还原成挥发性化合物质谱。每种化合物由以下多变量数据分析中的单个选择性离 子碎片代表。随后使用NIST质谱文库(http://胃w_nist.gov)，对化合物(质谱图中碎片离 子数目2 5)进行暂时鉴定。将可靠的身份归属于质谱匹配系数2 600的化合物。将挥发性化 合物丰度(强度)表现为色谱图中由MetAl ign软件检出的化合物的选择性质量峰的高度。某 些基因型中低于检测限的强度获得250和500之间的随机值。
[0168] 在BC2S1实验中，检出总计222种推定性挥发性化合物，其中22种挥发性物质是 PEN45特有的（即在全部队说植物和辣椒亲本中低于检测限）。可以将推定性身份归属至这 222种推定性挥发性化合物中的178种。在NIL实验中，检出总计137种推定性挥发性化合物。 可以将身份归属至这137种推定性挥发性化合物中的96种。
[0169] 用239个相对于SM和G匪在PEN45中呈多态性的SNP对来自其系谱中具有块状亲本 SM和G匪的PEN45BC2子群体的总计250株BC2S1植物进行基因分型。区间作图法，连同代谢物 (200种挥发性物质和6种非挥发性物质，88个试验区或植物)和几种物理果实特征(对于250 株植物或76个试验区）的各独立阶段，允许鉴定全部性状类别范围内的QTL。
[0170]在BC2S1 实验中程序MapQTL6(Van Ooijen ,MapQTL 6: software for the mapping of quantitative trait loci in experimental populations of diploid species (2009) Kyazma BV，Wageningen)内部的区间作图方法用于QTL鉴定。排列检验适用于每个数 据集（1 〇〇〇个排列）以确定LOD (几率对数)阈值。基因组级(GW) LOD阈值2.7用于QTL显著性(p 〈0.05)。认为具有最高LOD评分的染色体位置是最可能的QTL位置。曲线由MapChart软件 (Voorrips ,Journal of Heredity (2002 )93,77-78)产生。使用MapQTL6 内部的非参数 Kruskal-Wallis检验分析NIL实验以鉴定显示显著(p〈0.05)性状关联的标记。两项实验中 的分析均用l〇g2变换的代谢物数据进行。
[0171] 通过主成分分析法对NIL中检出的137种代谢物的初始分析明确了各基因型之间 的大部分代谢性变异由一组类萜引起。发现类萜水平的巨大变异，对于某些萜类，其最大浓 度几乎比最极端亲本中所检出的浓度高40倍。就类萜芳樟醇和对-薄荷-1-烯-9-醛而言，发 现了LG10.1上的主要QTL(L0D>10)和LGl上的对-薄荷-1-烯-9-醛特异性QTL(L0D4.1)(表 1)〇
[0172] 进一步观察具有这些LG10.1(NIL45、48和54)或LG1(NIL36和47)种质渗入的NIL揭 示，它们对成熟果实的类萜含量具有重大影响，影响至少15种不同类萜(表1hLGlO. 1和LGl 上的QTL仅影响单萜类积累，而倍半萜和二萜不受这两个种质渗入影响。在大多数情况下， 两个种质渗入导致相同化合物的上调，然而，某些类萜受这两个种质渗入之一特异性影响。 对于桉树脑，仅LGl种质渗入有效，并且对于(Ε)-β-罗勒烯，这种上调作用是对NIL45(N(HMB 42138)和NIL54(QTL3)中存在的LGlO. 1种质渗入特异的。LGlO. 1种质渗入的影响得到BC2S1 群体和NIL中显著的QTL支持(表1)。
[0173] 对于QTLl，LGl和LGlO. 1种质渗入片段的大小是4.6cM，而对于QTL2和QTL3，LG10.1 种质渗入片段的大小分别是2.5cM和6.3CM4TL2和QTL3同时位于18. OcM的种质渗入片段 上。这些大小基于导致这项发明的研究中所开发的遗传图（图2)。片段内标记的可用性促进 它们用于育种中。连锁群的命名参考共有染色体编号，如Wu等人，（Theor .Appl · Genet · (2009) 118,1279-1293)中那样。
[0174] 含有影响类萜含量的LGl种质渗入的NIL 36(Ν(ΠΜΒ 42140)和NIL 47的果实具有 与回归亲本相似的大小和果实颜色，从而使它们可直接用于育种。
[0175] 图注表1
[0176] 1元素组成
[0177] 2LGlO. 1和LGl分别指相应连锁群上在16.6cM处的标记SEQ ID No: 17和在20.2cM 处的SEQ ID No: 1。
[0178] 3指相LG10.1 上在6.3cM处的标记SEQ ID No: 13
[0179] 给出了解释方差百分数（％EV)、估计均值（μ，Van Ooi jen ,MapQTL 6 : software for the mapping of quantitative trait loci in experimental population