一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法。
【背景技术】
[0002] 铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall .ex Lindl)是兰科石斛属多年生附生草本 植物，是我国名贵的传统中药材之一，也是一种重要的花卉植物，分布于我国南方浙江、广 西、福建、贵州、云南、安徽等省的原始森林中，有益胃生津，滋阴清热，止咳润肺等功效。由 于生长环境特殊，长期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重点保护的野生药材。同时， 铁皮石斛的种子极小，无胚乳，自然条件下需与真菌共生才能萌发，繁殖速度慢，长势不一 且变异率高。
[0003] 20世纪70年开始，铁皮石斛的研究工作在组织培养、种植、药理药效方面发展很 快，但在铁皮石斛的组织培养中存在组培苗生产成本高，移栽成活率低等问题。铁皮石斛原 球茎是铁皮石斛离体培养产生的组织，具有植株的物质代谢和形态发育的潜能。一方面，铁 皮石斛原球莖可以分化成苗，培养成植株，或者作为人工种子繁殖体解决试管苗移栽的问 题，另一方面可以从原球茎中直接提取有效的药用成分，代替野生或栽培的植株。然而，铁 皮石斛原球茎通过固体培养进行增殖，50-60天继代一次，周期长增殖倍率不高，长势不均 匀。
[0004] 有鉴于此，本发明研发出一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，本案由 此产生。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，以提高增 殖倍率，实现产业化快速繁殖，该方法培育的铁皮石斛原球茎分化率高，干重鲜重含量提 高，移栽成活率相应提高。
[0006] 为达成上述目的，本发明的解决方案为：
[0007] -种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0008] -，对外植体进行清洗、消毒，然后接入诱导培养基中进行诱导培养，诱导培养基 配比为:MS培养基，6-BA 0 · lmg/L，NAA 0 · 3mg/L，100g/L土豆泥，PH5 · 6-5 · 8，培养条件是光 照强度1500-2000lux，光照时间1 Oh，温度25 ± 2°C ;
[0009] 二，将步骤一中诱导的原球茎接入液体增殖培养基中进行悬浮震荡培养，液体增 殖培养基为：1/2MS培养基，6-BA 2 · Omg/L，NAA 0 · 5mg/L，蔗糖30g/L，PH5 · 6-5 · 8，培养条件 为采用工业摇床进行悬浮震荡培养，转速l〇〇r/min，光照强度2000-25001UX，光照时间8h， 温度25 ±2 Γ;
[0010] 三，将步骤二中获得的原球茎转接到分化培养基中培养获得分化苗，培养基配方： 1/2MS培养基，6-BA 1 · 5-2 · 0mg/L，NAA 0 · 3-0 · 5mg/L，香蕉泥 100g/L，蔗糖20g/L，PH5 · 6-5.8，培养条件是光照强度2000-25001ux，光照时间12h，温度25 ± 2°C ;
[0011] 四，将步骤三中l_2cm高的苗转接到生根培养基中生根，生根培养基配比：1/2MS培 养基，NAA 1. Omg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度2000-25001ux，光照时间 12h，温度25 ± 2°C。
[0012] 进一步，步骤一中，选择长势旺盛的铁皮石斛幼嫩枝条为外植体，去除所有叶片， 切除顶芽，然后将外植体放入含洗衣粉的水中浸泡l〇min，清水冲洗干净转移至无菌操作台 上，用质量浓度为75 %的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用质量浓度为0.1 %的生汞消毒 7-8min，无菌水冲洗5次，沥干，将莖段切成2-3cm带节的莖段，接种到诱导培养基中。
[0013]进一步，步骤二中，铁皮石斛原球莖液体增殖培养所采用的瓶子为85mm耐高温PP 组培瓶，装液量为瓶身的1/5-1/6，接种量为其装液量的10 %-15 % (质量浓度），置于旋装式 工业摇床上进行震荡培养。
[0014] 进一步，1/2MS培养基主要由 1000mg/L NH4N03、1500mg/L KN03、170mg/L KH2P〇4、 300mg/L无水CaCl2和 185mg/L MgS〇4 · 7H20组成。
[0015] 采用上述方案后，本发明解决铁皮石斛原球茎增殖过程中周期长，增殖倍率低，生 产成本高等问题，实现商业化规模化快速繁育，45天增殖倍率达20-23倍，原球茎的干重达 到27.02g/L，分化效果好，生根率100 %，满足工业化生产，为铁皮石斛的推广种植解决种苗 需求问题。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合具体实施例对本发明做详细描述。
[0017] -种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0018] -，外植体的预处理和诱导
[0019] 选择长势旺盛的铁皮石斛幼嫩枝条为外植体，去除所有叶片，切除顶芽，然后将外 植体放入含洗衣粉的水中浸泡l〇min，自来水冲洗干净转移至无菌操作台上，用质量浓度 为75 %的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用质量浓度为0.1 %的生汞消毒7-8min，消毒过 程中轻轻晃动瓶子使之充分接触，最后无菌水冲洗5次，每次2min，沥干，将茎段切成2-3cm 带节的茎段，接种到诱导培养基中。培养条件:光照强度1500-20001uX，光照时间10h，温度 25±2°C，诱导培养基本培养基为MS培养基，土豆泥100g/L，分别添加不同浓度的6-BA和 NAA，考察激素对原球茎诱导的影响，结果见表1。从表1中可以看出较适合原球茎诱导的是 实验组合2，原球茎诱导培养基为MS、6-BA 0. lmg/L、NAA0.3mg/L。
[0020] 表1不同激素组合对原球茎诱导率的影响
[0021]
[0022] 二、铁皮石斛原球茎液体增殖培养
[0023] 将诱导萌发的铁皮石斛原球茎直接接入到液体培养基中进行增殖培养，原球茎的 液体增殖每隔15天更换一次培养液，换液时保留部分原有培养基再加入新鲜培养基，培养 45天后进入筛选程序，挑选结构紧密，颗粒饱满，颜色鲜绿，直径大的原球茎进入分化阶段 培养成分化苗；同时，当液体增殖的生物量达到一定程度时，可以将该原球茎做成药源植 物，提取有效成分。
[0024] 1、液体增殖培养采用旋转式大型工业摇床进行原球茎液体悬浮震荡培养，铁皮石 斛原球茎液体增殖培养所采用的瓶子为85mm耐高温PP组培瓶，培养液的量为50ml，接种量 为7_8g。
[0025] 2、基本培养基及激素的选择对原球茎液体增殖的影响
[0026] 2.1不同培养基对原球茎液体增殖的影响
[0027] 不同基本培养基中盐浓度差异较大，盐浓度不同导致渗透压差异很大，这对原球 茎的增殖具有重要影响且影响后期的分化，因此选取合适的基本培养基至关重要。选取相 同条件下生长状况良好的原球茎接到液体培养基中，以15、1/21^、85、册为基本培养基，蔗 糖30g/L，30天后观察原球茎增殖情况，见表2。由表2可以看出1/2MS较适宜作为原球茎液体 增殖的基本培养基，B5、N6由于含有高的钾盐浓度不利于原球茎增殖导致原球茎脱水死亡。
[0028] 表2不同培养基对原球茎液体增殖的影响
[0029]
[0031 ] 2.2不同激素对原球茎液体增殖的影响
[0032] 激素种类及浓度对原球茎的增殖有重要的影响作用，前期实验显示对原球茎液体 增殖有明显影响的激素为6-BA和NAA，故本方案主要考虑6-BA、NAA两种激素组合对原球茎 液体增殖的影响。基本培养基为1/2MS，蔗糖30g/L，接种量7-8g/瓶，装液量50ml/瓶，光照强 度2000-25001ux，时间12h，PH5.6-5.8，转速100r/min，45天后1瓶原球茎可以转接9-11瓶原 球茎，按9瓶计算鲜重干重及增殖倍率，结果见表3。由表3可以看出不同浓度的激素组合对 原球茎的液体增殖倍率影响