一种成功使茭白植株孕茭的菰黑粉菌人工接种方法
【专利摘要】一种成功使茭白植株孕茭的菰黑粉菌人工接种方法，属于茭白人工接种技术领域。本发明利用菰黑粉菌中筛选得到的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2接种于野茭中，使其成功孕茭。该方法操作简单、有效，为茭白育种提供了一个新的方向。CGMCC No.1184420151207CGMCC No.1184320151207
【专利说明】
一种成功使茭白植株孕茭的菰黑粉菌人工接种方法
技术领域
[0001 ]本发明属于茭白人工接种技术领域，具体涉及一种成功使茭白植株孕茭的菰黑粉 菌人工接种方法。
【背景技术】
[0002] 菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌 近源。目前为止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是茭白植株与该专一性地寄生在体 内的菰黑粉菌共同作用的结果。至今，茭白的种植及保种育种还是采用茭墩分离筛选的方 式，人力物力投入较大，而且菰黑粉菌存在多个生理小种，其可能混合存在于茭白植株中， 造成茭白品种性状不稳定，退化明显。因此采用人工接种方式是茭白育种的发展方向。但是 迄今为止没有有效的菰黑粉菌人工接种方法。我们通过分离得到了多对性亲和的单倍体菰 黑粉菌菌株，经多次实验条件摸索，建立了一套菰黑粉菌人工接种标准方法，可以使野生茭 白植株成功孕菱。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种成功使茭白植株孕茭 的菰黑粉菌人工接种方法的技术方案。
[0004] 所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在于包括以下 步骤： 1) 将·黑粉菌（Ustilago esculenta)单倍体菌株UET1和·黑粉菌（Ustilago esculenta)单倍体菌株UET2分别在YEPS液体培养基中25-30 °C摇菌至0D6(x)为0 · 8-1 · 0，离心 收集菌体，用0.5 X YEPS液体培养基稀释成终浓度为0D6Q()为2.0-3.0的菌液，将两菌液混合 用于接菌； 2) 将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，温室培养15-20天，以萌发有3个以 上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理； 3) 将步骤1)得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止； 4) 将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余 的混合菌液中，22-25°C温室黑暗放置12-24 h; 5) 将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合 菌液倒入土中，22-25°C温室黑暗培养7 d，完成接种； 6) 将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥 参考正常茭白种植标准。
[0005] 所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在于所述的步 骤1)中·黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株UET1保藏号为:CGMCC No. 11843,所述 的·黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株UET2保藏号为:CGMCC No. 11844。
[0006] 所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在于所述的步 骤1)中YEPS液体培养基中含有以下组分:蛋白胨2%、蔗糖2%、酵母粉1%和水余量。
[0007] 所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在于所述的步 骤2)中温室培养条件温度控制在22-25°C，光照时间为8-12h。
[0008] 所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在于所述的步 骤4)中浸没茎基部扎孔处为准。
[0009] 所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在于所述的步 骤5)中小盆体积为3-5 L。
[0010] 本发明中的菰黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株UET1于2015年12月07日 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.11843,保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明中的菰黑粉菌 (Ustilago esculenta)单倍体菌株UET2于2015年12月07日在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No. 11844,保藏单位地址为:北京市 朝阳区北辰西路1号院3号。
[0011] 本发明利用黑粉菌中筛选得到的·黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株 UET1和·黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株UET2接种于野菱中，使其成功孕菱。该 方法操作简单、有效，为茭白育种提供了一个新的方向。
【附图说明】
[0012] 图1为·黑粉菌（Ustilago esculenta)单倍体菌株UET1和·黑粉菌（Ustilago esculenta)单倍体菌株UET2获得途径示意图。
[0013] 图2为茭白组织切片。过表达EGFP菰黑粉菌人工接种茭白植株使其孕茭后，将茭白 进行组织切片并在荧光显微镜下观察。A，田间茭白的组织切片（对照）；B，人工接种野茭孕 茭后冬孢子富集区组织切片;C，人工接种野茭孕茭后肉眼未见冬孢子区组织切片。
[0014] 图3为菌种及交配型基因的PCR鉴定结果图。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0016] 实施例1 :黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株UET1和·黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株UET2的筛选，如图1所示。
[0017] 1.收集冬孢子:从龙茭2号灰茭中（图1A)直接挑取冬孢子。
[0018] 2.冬孢子悬液:将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经4层灭菌纱布过滤，获得 较纯的冬孢子悬液，最后再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为1〇3个孢子/mL。冬孢子 形态如图1B所示。
[0019] 3.冬孢子培养:取100 yL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28°C培养约60 h，以肉眼可见细小分散的单菌落（图1C)为标准。担孢子分离培养基（1 L)配方为:K2HP04 1 g，MgS〇4.7H20 0.5 g，FeS〇4.7H20 0.01g，KCl 0.5 g，葡萄糖 18 g，（NH4)2S〇4 5.28 g，琼 脂10 g〇
[0020] 4.单孢分离培养:挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成103个孢子/mL，每次 取1 yL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子（图1D)，将分离出的担孢子在YEPS (蛋白胨2%，蔗糖2%，酵母粉1%，琼脂粉1.5%，水余量)固体培养基上，28°C培养4 d。一个单菌 落分离5个担孢子，取3个以上单菌落。担孢子培养后的菌落形态如图1E所示。
[0021] 5.显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘 光滑(图1Π 则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝(图1G)，则舍弃。
[0022] 6.性亲和菌株筛选:将初步鉴定的单倍体菌株编号（图1E)，并用YEPS液体培养基 分别稀释成浓度为〇D_为2.0的菌液。通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定。融合 反应实验如图1H，具体过程为:将1号菌液先在YEPS固体培养基上进行点样，每个点1 uL，总 点样数为分离得到的单倍体菌株数。之后将剩余的各菌液各取1 UL分别覆盖于1号菌株菌 点上方，标记菌株号，于28°C培养箱中培养4 d。培养后对菌落形态进行肉眼观察，若可见白 色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株。如图1H中所示，1号菌株与 2、3、4、8或11号菌株可能为性亲和单倍体菌株。
[0023] 7. PCR鉴定:通过对其交配型位点的克隆分析，发现菰黑粉菌中存在3个信息素受 体pra基因，分别为pral，pra2和pra3，pral的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，pra2的核苷 酸序列如SEQ ID N0:2所示，pra3的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。众所周知，一个单倍体 菌株中只可能存在一个pra基因，而两个性亲和的单倍体菌株中pra基因不一样。因此设计 特异性引物用于进一步对筛选得到的单倍体进行PCR验证，并进一步确认彼此间的性亲和 性。
[0024]以上述筛选到的12个单倍体菌株为例，提取各菌株的DNA，先通过引物ITS1和ITS4 扩增ITS序列并测序进行菌种鉴定，PCR结果如图3D所示，测序结果经NCBI比对后表明均属 于Ustilago esculenta。接下来我们对各个菌株基因组DNA中的pral，pra2和pra3进行PCR 扩增，结果如图3A，B，C所不，表明2、4号菌株的信息素受体基因为口抑3,3、8、11号菌株的信 息素受体基因为pral，其余菌株的信息素受体基因为praSlCR扩增反应体系为：10 XPCR缓 冲液5 yL，dNTP 4 yL，上游引物1 yL，下游引物1 yL，DNA模板1 yL，Taq酶0.5 yL，加 ddH20 至50 yl^PCR扩增程序为94 °C 4 min;94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 2 min，30个循环； 72 °C 10 min;4 °C终止，扩增片段长度均在600 bp上下，引物序列如下：
[0025] 8.确定单倍体菌株：当采用引物pral-F和pral-R扩增后得到长度在600 bp上下扩 增片段的菌株确定为单倍体菌株UET1，当采用引物pra2-F和pra2-R扩增后得到长度在600 bp上下扩增片段的菌株确定为单倍体菌株UET2。单倍体菌株UET1和UET2,在YEPS培养基上 进行融合反应，结果，UET1和UET2可以融合形成白色气生菌丝，对菌丝基因组进行PCR鉴定 后表明菌丝中同时含有pral和pra2基因。
[0026] 黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株UET1和UET2具有以下性质：形态特 征:短杆状，成熟的孢子在15-20微米左右，单核无隔膜，进行芽殖，似酵母菌，但比酵母菌 大。培养特性：固体培养菌落呈乳黄色，表面光滑，较湿润，比细菌菌落更大更厚，挑取时比 细菌粘稠，类似酵母菌落。液体培养液如细菌菌液。生理代谢特性:该菌株偏好还原性糖和 有机氮源作为其生长的碳氮源。培养方法:可体外培养，适于在roA或YEPS固体培养基上进 行单菌落划线培养，在液体培养中培养容易降低该菌活性。另外该菌不适宜继代三次以上， 不适宜7天以上的连续培养或低温放置，否则造成活性降低或菌体降解，适宜在-80度20%甘 油保藏。
[0027] 实施例2:接种方式、接种对象和接种时间的选择 将·黑粉菌（Ustilago esculenta)单倍体菌株UET1和·黑粉菌（Ustilago esculenta)单倍体菌株UET2分别在YEPS液体培养基中25-30 °C摇菌至0D6QQ为0 · 8-1 · 0，离心 收集菌体，用0.5 X YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD600为2.0-3.0的菌液，将两菌液混合 得到混合菌液。
[0028] 以采自吴江的野茭管状根作为接种对象，根据其芽和叶的生长情况，分为芽期、小 苗期和苗期三种，要求每段管状根需要3个以上的芽或苗，同时保留3-5节完整节间；采用7 种接种方式(表1)在3月底及4月底两个时期分别进行人工接种。10月统一观察发现：只有小 苗期的野茭采用第⑤种接种方法接种后能使野茭孕茭，其余接种方式接种后与对照无明显 区别。同时观察发现3月份接种能得到正常大小的茭白，而4月份接种得到的茭白明显偏小， 而且节位较高。
[0029] 表1不同接种方式组合列表
表1中1表示管状根注射步骤;2表示苗、茎基部扎孔步骤;3表示管状根22-25 °C混合菌 液黑暗浸置处理12-24小时;4表示管状根25°C带土黑暗培养7天;5表示管状根露天培养步 骤。
[0030] 实施例3:验证试验 为了进一步确认致使茭白孕茭的是人工接种的菰黑粉菌，采用过表达EGFP的菌株 UET1-EGFP和UET2-EGFP混合侵染方式，在3月底采用第⑤种接种流程侵染小苗期的野茭，成 功使茭白孕茭，同时对茭白进行组织切片后在荧光显微镜下观察到冬孢子和菌丝中具有 EGFP过表达产生的绿色荧光信号，表明该茭白中的菌为我们人工接种的过表达EGFP的菰黑 粉菌（图2)。
【主权项】
1. 一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将·黑粉菌（Ustilago esculenta)单倍体菌株UET1和·黑粉菌（Ustilago esculenta)单倍体菌株UET2分别在YEPS液体培养基中25-30 °C摇菌至0D6QQ为0 · 8-1 · 0，离心 收集菌体，用0.5 X YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD600为2.0-3.0的菌液，将两菌液混合 用于接菌； 2) 将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，温室培养15-20天，以萌发有3个以 上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理； 3) 将步骤1)得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止； 4) 将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余 的混合菌液中，22-25°C温室黑暗放置12-24 h; 5) 将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合 菌液倒入土中，22-25°C温室黑暗培养7 d，完成接种； 6 )将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥 参考正常茭白种植标准。2. 如权利要求1所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在 于所述的步骤1)中·黑粉菌（Usti lago esculenta)单倍体菌株UET1保藏号为：CGMCC No · 11843，所述的黑粉菌（Usti lago esculenta)单倍体菌株UET2保藏号为：CGMCC No.11844。3. 如权利要求1所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在 于所述的步骤1)中YEPS液体培养基中含有以下组分：蛋白胨2%、蔗糖2%、酵母粉1%和水余 量。4. 如权利要求1所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在 于所述的步骤2)中温室培养条件温度控制在22-25°C，光照时间为8-12 h。5. 如权利要求1所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在 于所述的步骤4)中浸没茎基部扎孔处为准。6. 如权利要求1所述的一种成功使菱白植株孕菱的黑粉菌人工接种方法，其特征在 于所述的步骤5)中小盆体积为3-5 L。
【文档编号】A01G1/00GK105830760SQ201610058050
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年1月28日
【发明人】张雅芬, 叶子弘, 俞晓平, 崔海峰
【申请人】中国计量学院