一种实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法
【专利摘要】本发明涉及一种实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法，该方法能够实验前期对紫贻贝的性别进行区分，为毒理学实验设计的精确化精细化提供保障，同时还能保证实验的长期可持续性及操作性。本发明可应用于在实验前确定紫贻贝性别的鉴定，有益于更加精确的对实验进行设计和操作，同时这种方法实现了在性别鉴定的前提下，使生物样本处于存活条件，可以降低实验处理样本总数，同时能够为多种后续的实验提供了良好的可操作空间及可能性。同时，该方法在贝类遗传、育种实验及精子库建立等有应用的潜力。
【专利说明】
-种实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法
技术领域
[0001] 本发明属于环境生态学技术领域，设及一种实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢 复方法。
【背景技术】
[0002] 紫贻贝是我国常见的海水养殖贝类，在人们日常的餐桌上经常出现。在我国W山 东、迂宁、广东、福建、浙江等省的养殖规模较大。贻贝的营养价值仅次于鸡蛋，素有"海中鸡 蛋"之美称。《本草纲目》载述贻贝可治虚劳伤急，吐血久频等疾病。贻贝可W鲜食或加工成 干品，也可制成各种类型罐头，贻贝加工的肉汤，可W制成美味可口的贻贝油。贻贝的贝壳 可作电石、纽扣、贝雕、石灰、饲料和肥料，具有极高的经济价值。常见的养殖贻贝包括紫贻 贝、厚壳贻贝、悲翠贻贝等。
[0003] 贻贝为营固着、滤食性生物。紫贻贝大多生活在低潮线W下1-3米处;厚壳贻贝分 布于低潮线W下20米水深处，W5-10米水层最多；悲翠贻贝分布在潮间带至低潮线W下15 米，在南海W低潮线W下1-2米水层为最多。鉴于其环境分布广泛及其生活特征，贻贝常作 为环境变化的指示生物，用W检测近海海域及港口码头的水质污染状况。
[0004] 随着人类进入工业时代，大量的化学品的使用造成了环境中化学污染的日益严 重。在实验室条件下，通过模拟实验，对化学物质的毒性效应进行研究，有助于我们确定化 学品的合理使用规模，有助于我们对化学物质的毒性效应及机制的了解，有助于为今后解 决化学物质毒性效应提供合理的解决方案。在众多的环境化学污染物质中，有许多具有环 境激素的特征，能够改变生物的性激素分泌水平，对生物具有生殖毒性。利用贻贝在实验室 模拟实验，对化学物质对海洋生物的可能作用做出预估具有重要意义，其中化学物质对不 同性别的贻贝的胁迫造成的生理生态及分子水平的差异也越发受到研究者的关注。然而， 常用的贻贝的性别的鉴别方法是在其性成熟的阶段，通过观察生殖腺颜色，或通过观察贻 贝排精排卵现象来实现的。贻贝的生殖系统为生殖腺一对，包被于内脏团外，随着生殖腺的 发育，逐渐扩展到腹崎内W及两侧外套膜内。在贝类生殖腺发育完善时，其性腺能够延伸至 外套膜及后闭壳肌肉。贻贝性成熟时，雄性性腺呈现乳白色，雌性性腺呈现澄红色，此时可 根据性腺颜色对贻贝进行性别区分，在非生殖期引起性腺不发达，不易于区分贻贝性别。因 此上述两种方法中，前者必须通过处死贻贝的方式来观察性腺颜色，从而对性别进行区分， 造成了实验设计前期样品选择分配的困难，及不易于长期实验的缺陷；而后者因实验室条 件下，排精排卵时易造成水质浑浊，不易区分，且因排精排卵后贻贝生理状态较差，易造成 死亡，同样存在缺陷。
[0005] 贻贝的贝壳具有保护软体动物软体部，W保障其生存的功能。贝类的贝壳在物理 冲击力的胁迫下，会发生破裂，当贝壳大面积受损缺失时，会使其软体部直接暴露于外界水 环境中，使其极易遭受水环境中的细菌等侵蚀，造成贝类死亡。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种实验用紫贻贝活体性别鉴 定及生长恢复方法，该方法能够实验前期对紫贻贝的性别进行区分，为毒理学实验设计的 精确化精细化提供保障，同时还能保证实验的长期可持续性及操作性。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[000引一种实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法，具体步骤如下：
[0009] 1)采集紫贻贝，用海水进行冲洗，洗净表面泥沙，对于密集聚集在一起的贻贝，选 取其足丝聚集的区域，利用手术剪刀，剪断足丝，进行个体分离；
[0010] 2)分离后的个体，用70%的酒精擦拭表面灭菌；
[0011] 3)将紫贻贝固定于固定装置上，进行生殖细胞的采集;具体采集方法如下：利用 微型电钻，在紫贻贝排泄空腔处进行打孔;之后用将注射器的针头从钻孔处深入，对性腺细 胞进行抽取；
[0012] 4)鉴别:抽取物在400倍显微镜下观察，如果具有鞭毛型精子，则为雄性;如果具有 圆形黄卵，则为雌性；
[0013] 5)鉴别完性别后的紫贻贝根据性别放置在不同的养殖箱内，养殖箱采用透明材 质；投放密度大于250ml海水/贝；养殖箱内海水先经过0.45μπι的滤膜抽滤，后经高压灭菌 (12rC，20min)灭菌后，冷却使用；
[0014] 6)饲养条件：水溫18 ± 2°C，盐度在30 ± 3psu，pH为8.1 ± 0.1，该过程中，使用循环 累对养殖水体进行循环水处理，同时进行曝气；
[001引7)巧料投喂:每天200ml藻液/贝喂养，藻液浓度3*104个/ml,在换水前5小时投喂， 海水每天更换一次。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明可应用于在实验前确定紫贻贝性别的鉴定，有益于更加精确的对实验进行 设计和操作，本发明在排泄腔钻孔，不会对贝类造成明显影响，且其创口较小，经过实验室 的实验验证，不影响其正常的存活状态。同时运种方法实现了在性别鉴定的前提下，使生物 样本处于存活条件，可W降低实验处理样本总数，同时能够为多种后续的实验提供了良好 的可操作空间及可能性。同时，该方法在贝类遗传、育种实验及精子库建立等有应用的潜 力。本发明中所设及到的固定装置可W有效的固定紫贻贝，为后续的抽取性腺提供稳定的 环境；同使，软垫的使用，可W有效防止在钻孔过程中紫贻贝贝壳的破损；固定架中部设置 的凹槽，可W更加有效的固定紫贻贝。
【附图说明】
[001引本发明有如下附图：
[0019] 图1为本发明装置的主视视角结构示意图；
[0020] 图2为本发明装置的左视视角结构示意图；
[0021 ]图3为本发明装置的仰视视角结构示意图；
[0022] 图4为本发明所述固定架的结构示意图。
【具体实施方式】
[0023] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范 围。
[0024] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0025] 实施例1
[0026] 如图1-图4所示，一种紫贻贝固定装置，包括:固定板1、固定架2、活动架3、弹黃4和 槽架8;所述槽架8固定于所述固定板1两侧;所述固定架2穿过槽架8;所述活动架3穿过槽架 8;所述固定架2与所述活动架3通过弹黃4连接。
[0027] 使用时，将紫贻贝放置在固定架2和活动架3之间，在弹黃4的弹力的作用下，紫贻 贝被固定在固定架2和活动架3之间。
[0028] 为了提高紫贻贝的固定效果，所述固定架2与所述固定板1固定连接。所述固定板1 上设置有软垫5,软垫5的设置，可W防止紫贻贝在钻孔时贝壳的破碎。所述固定架2中部设 置凹槽7,凹槽7设置的可W更加稳定的固定紫贻贝。
[0029] 实施例2
[0030] -种实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法，具体步骤如下：
[0031] 1)采集紫贻贝，针对不同的采集地点，可通过下述方式进行处理：1、对于养殖场内 采集的贻贝，可使用下述方法进行个体分离:养殖区贻贝往往成群密集的附着于养殖用Ξ 角带上，可对Ξ角带进行截取，便于操作。在分离过程中，先利用手术剪刀，延Ξ角带，将贻 贝足丝剪断，将成群的贻贝从Ξ角带上剥离下来，后利用手术刀或手术剪，延贻贝壳的腹 部，将个体的足丝剪断，使其个体分离。2、对于部分用扇贝笼式饲养的贻贝，可打开扇贝笼， 利用手术刀/手术剪，延笼底对贻贝进行分离，分离后的贻贝如有成群者，可利用手术刀/手 术剪延壳腹部剪断足丝进行个体分离。3、对于近海野生的贻贝，可利用手术刀/手术剪，延 礁石和贻贝附着的界限，对足丝进行剪断处理，进行个体分离。分离后的贻贝个体放置于海 水中，在海水中洗净泥沙，备用；
[0032] 2)分离后的个体，用70%的酒精擦拭表面灭菌；
[0033] 3)将紫贻贝固定于固定装置(实施例1的固定装置)上，进行生殖细胞的采集;具体 采集方法如下:利用微型电钻，在紫贻贝排泄空腔处进行打孔;之后用将注射器的针头从钻 孔处深入，对性腺细胞进行抽取；
[0034] 4)鉴别:抽取物在400倍显微镜下观察，如果具有鞭毛型精子，则为雄性;如果具有 圆形黄卵，则为雌性；
[0035] 5)鉴别完性别后的紫贻贝根据性别放置在不同的养殖箱内，养殖箱采用透明材 质；投放密度大于250ml海水/贝；养殖箱内海水先经过0.45μπι的滤膜抽滤，后经高压灭菌 (12rC，20min)灭菌后，冷却使用；
[0036] 6)饲养条件：水溫18 ± 2C，盐度在30 ± 3psu，pH为8.1 ± 0.1，该过程中，使用循环 累对养殖水体进行循环水处理，同时进行曝气；
[0037] 7)巧料投喂:每天200ml藻液/贝喂养，藻液浓度3*104个/ml,在换水前5小时投喂， 海水每天更换一次。
[0038] 步骤3)中对性腺细胞进行抽取的具体步骤是:在紫贻贝生殖旺盛期或生殖期，抽 取方法为:注射器针头从钻孔处插入，沿背部方向穿过闭壳肌至闭壳肌前端，对性腺细胞进 行抽取;在生殖季前期准备阶段或后生殖期，抽取方法为:注射器针头从钻孔处插入，向紫 贻贝腹部方向深入，在近外套膜处进行抽取。
[0039] 步骤7)中的藻液为混合巧料藻，选自小球藻、球等鞭金藻、角毛藻和青岛大扁藻中 的两种W上。
[0040] 在实验室条件下，对本发明方法进行验证。验证条件为选取实验贻贝个体100个， 在其生殖期和生殖前期/后期进行性别鉴定，鉴定后，利用上述方法进行恢复，记录恢复时 期的存活率，恢复时期为1个月，在恢复期结束后，对样本进行解剖验证。其具体的实验数据 如下表所示：
[0041]
[0042] 上述实施方案为本发明最佳的实施方案，但本发明的实施方案并不受上述实施方 案的限制，其他的任何不违背本发明原理的条件下，可W通过改变参数的形式所产生的实 施例，都包含于本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 采集紫贻贝，用海水进行冲洗，洗净表面泥沙，对于成团的贻贝，选取其足丝聚集的 区域，利用手术剪刀，剪断足丝，进行个体分离； 2) 分离后的个体，用70 %的酒精擦拭表面灭菌； 3) 将紫贻贝固定于固定装置上，进行生殖细胞的采集;具体采集方法如下:利用微型电 钻，在紫贻贝排泄空腔处进行打孔;之后用将注射器的针头从钻孔处深入，对性腺细胞进行 抽取； 4) 鉴别:抽取物在400倍显微镜下观察，如果具有鞭毛型精子，则为雄性;如果具有圆形 黄卵，则为雌性； 5) 鉴别完性别后的紫贻贝根据性别放置在不同的养殖箱内，养殖箱采用透明材质；投 放密度大于250ml海水/贝；养殖箱内海水先经过0.45μπι的滤膜抽滤，后经高压灭菌（121°C， 20min)灭菌后，冷却使用； 6) 饲养条件:水温18 ± 2°C，盐度在30 ± 3psu，pH为8.1 ± 0.1，该过程中，使用循环栗对 养殖水体进行循环水处理，同时进行曝气； 7) 饵料投喂:每天200ml藻液/贝喂养，藻液浓度3*104个/ml，在换水前5小时投喂，海水 每天更换一次。2. 根据权利要求1所述的实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法，其特征在于，步 骤3)中的固定装置包括固定板（1)、固定架（2)、活动架(3)、弹簧(4)和槽架(8);所述槽架 (8)固定于所述固定板(1)两侧;所述固定架(2)穿过槽架(8);所述活动架(3)穿过槽架(8); 所述固定架(2)与所述活动架(3)通过弹簧(4)连接。3. 根据权利要求2所述的实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法，其特征在于，所 述固定架(2)与所述固定板(1)固定连接;所述固定板(1)上设置有软垫(5);所述固定架(2) 中部设置凹槽(7)。4. 根据权利要求1所述的实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法，其特征在于，步 骤3)中对性腺细胞进行抽取的具体步骤是:在紫贻贝生殖旺盛期或生殖期，抽取方法为:注 射器针头从钻孔处插入，沿背部方向穿过闭壳肌至闭壳肌前端，对性腺细胞进行抽取;在生 殖季前期准备阶段或后生殖期，抽取方法为:注射器针头从钻孔处插入，向紫贻贝腹部方向 深入，在近外套膜处进行抽取。5. 根据权利要求1所述的实验用紫贻贝活体性别鉴定及生长恢复方法，其特征在于，步 骤7)中的藻液为混合饵料藻，选自小球藻、球等鞭金藻、角毛藻和青岛大扁藻中的两种以 上。
【文档编号】A01K61/00GK105918183SQ201610364956
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】王悠, 姜永顺, 唐学玺
【申请人】中国海洋大学