基于聚合物的移植用保存溶液的制作方法

基于聚合物的移植用保存溶液的制作方法
【专利摘要】本发明提供了器官保存溶液，包括聚甘油，其中，该聚甘油的分子量在约0.15kDa至约3.99kDa之间，还提供了方法和用途以及制备所述器官保存溶液的设备。
【专利说明】
基于聚合物的移植用保存溶液
技术领域
[0001] 本发明涉及聚甘油领域。特别地，本发明涉及基于聚甘油的移植用保存溶液及其 用途。
【背景技术】
[0002] 在供体器官切取过程中，利用冷的保存溶液冲洗、存储供体器官是一种减少缺血 性损伤常见的方法。为此，各种存储溶液和各种存储技术得到了开发，并取得了不同程度的 成功，这其中就包括现代灌流技术。从超过标准的供体中移植肾，会出现移植肾功能延迟恢 复问题，而目前，这些超过标准的供体是用UW溶液、Ce I s i or溶液、HTK溶液进行冲洗和存储 的（Agarwal et al·，2006;Montalti et al·，2005;Stevens et al·，2009)〇
[0003] 不同的保存溶液在成分上有较大程度地不同，但通常它们旨在防止细胞和间质水 月中、细胞死亡，即旨在使移植后的器官的功能最大化。UW溶液可以同时用于主动脉的原位冲 洗和肾脏、心脏、肝脏和胰腺的体外冷藏。然而，在UW溶液中加入羟乙基淀粉(HES)对其在冷 藏器官(特别是来源于已故供体的器官)方面的应用有负面影响。羟乙基淀粉通常被用于危 重患者容量复苏的胶体，但最近，其安全性存在问题;利用羟乙基淀粉进行液体复苏伴有凝 血障碍、瘙痒和急性肾损伤（Hartog and Reinhart，2009;Perner et al.，2012;Perner et al ·，2011; Schortgen et al ·，2001;Winkelmayer et al · ,2003)，并在移植后，损害直接供 体的肾功能并在移植后，损害的直接供体的肾功能Cittanova et al. ,1996)。
[0004] 超支化聚甘油(HPG)是一种水溶性支化聚醚聚合物，其已经在许多医学应用中被 研究，例如作为白蛋白的替代物存储循环血量(Kainthan et al. ,2008)以及作为主要渗透 剂运用于腹膜透析液（Mendelson et al.，2013)。超支化聚甘油是一个高度水溶性（> 400mg/mL)且紧凑的聚合物，其具有与聚乙二醇同等或更好的生物相容属性，超支化聚甘油 的固有粘度低，类似于蛋白质并且比线性聚合物（即聚乙二醇、羟乙基淀粉、右旋糖酐)低大 约10倍(Kainthan et al.，2008;ul_Haq et al. ,2012);以及，超支化聚甘油甚至在非常高 的浓度下，既不会使蛋白质沉淀也不会使细胞团聚（如红细胞）（Liu et al.，2010;Rossi et al.，2010;ul_Haq et al.，2012)。

【发明内容】

[0005] -方面，本申请提供一种移植用保存溶液，包括聚甘油，其中，该聚甘油的分子量 在约0.15kDa至约3.99kDa之间。在一些实施例中，聚甘油的分子量在0.20kDa至约3.95kDa 之间，或在约0.50kDa至约3kDa之间，或在约0.75kDa至约2. OkDa之间。每个聚合物的分子量 均通过凝胶渗透色谱法和核磁共振谱确定。
[0006] 在一些实施例中，该移植用保存溶液为水溶液。在一个实施例中，该聚甘油占该移 植用保存溶液重量的约〇.01 %至约50%，或占该移植用保存溶液重量的约0.2%至约40%， 或占该移植用保存溶液重量的约0.4%至约30%，或占该移植用保存溶液重量的约0.6%至 约25%，或占该移植用保存溶液重量的约1%至约23%，或占该移植用保存溶液重量的约 1.25%至约 20%。
[0007] 在一些实施例中，移植用保存溶液的pH在约2.0至9.0之间，或在约5.0至约7.9之 间，或在约5.1至约7.9之间，或在约6.0至约7.6之间，或在约6.1至约7.6之间，或在约6.2至 约7.6之间，或在约6.3至约7.6之间，或在约6.4至约7.6之间，或在约6.5至约7.5之间。
[0008] 在一些实施例中，该移植保护溶液的渗透压浓度在约150m0sm/L至约1500m0sm/L 之间，或者在约240m0sm/L至约600m0sm/L之间，或者在约290m0sm/L至约580m0sm/L之间，或 者在约290m0sm/L至约480m0sm/L之间，或者在约290m0sm/L至约460m0sm/L之间，或者在约 290m0sm/L 至约 450m0sm/L之间。
[0009] 在一些实施例中，该聚甘油的分支度在约0.5至0.7之间，或者在约0.6至约0.7之 间，或者在约0.5至约0.6之间，或者在约0.55至约0.7之间，或者在约0.55至约0.65之间。
[0010] 在一些实施例中，该移植用保存溶液包括至少两种聚甘油，其中，该至少两种聚甘 油中的每一种的分子量均不相同。
[0011] 在一些实施例中，该移植用保存溶液包括单一分子量的聚甘油。
[0012] 在一些实施例中，该移植用保存溶液包括单一分子量的聚甘油，在一些实施例中， 仅包括一种聚甘油，在另一些实施例中，包括至少两种分子量相同、化学结构不同的聚甘 油。
[0013] 在一些实施例中，该聚甘油还可以包括一个或多个疏水基团、一个或多个亲水基 团，或者两者兼具。
[0014] 在一些实施例中，该聚甘油约1 %至约100%的羟基上连接有一个或多个疏水基 团、一个或多个亲水基团，或者两者兼具。
[0015] 在一些实施例中，该聚甘油约1 %至约40%的羟基上连接有一个或多个疏水基团、 一个或多个亲水基团，或者两者兼具。
[0016] 在一些实施例中，一个或多个疏水基团、一个或多个亲水基团或者两者兼具包括 羧酸、胺、取代胺、氨基酸、磷酸、硫酸、烷基、烷基醚、芳基、两性基团、糖类、金属螯合组、活 性氧清除基、二硫化物、硫醇中的一个或多个。
[0017] 在一些实施例中，该移植用保存溶液进一步包括一种或多种抗氧化剂、核苷、酸、 碱、黄嘌呤氧化酶抑制剂、扩散剂、渗透剂、乳糖醛酸、维生素、蛋白质、生长因子、抗炎剂、细 胞死亡抑制剂、细胞膜稳定剂。
[0018] 在一些实施例中，本发明提供了一种移植用保存溶液，包括这里描述的超支化聚 甘油(HPG)。
[0019] 在一些实施例中，本申请提供了一种移植用保存溶液，包括超支化聚甘油，其中， 该超支化聚甘油的分子量在约〇.15kDa至约3.99kDa之间。在进一步的实施例中，聚甘油的 分子量在〇 . 20kDa至约3.95kDa之间，或在约0.50kDa至约3kDa之间，或在约1.0 kDa至约 2. OkDa之间。
[0020] 另一方面，将此处描述的移植用保存溶液用于限制在器官切取和移植过程中的供 体器官损伤，其中，器官移植可以是同种异体移植、同系异体移植或自体移植。其中，器官可 以包含心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠、脾脏、四肢(包括手指/脚趾）、性器官和胸腺。
[0021] 另一方面，提供此处描述的移植用保存溶液用于限制在组织切取和移植过程中的 供体组织损伤，其中，组织移植可以是同种异体移植、同系异体移植或自体移植。这些组织 包括骨骼、肌腱(称为肌肉骨骼移植）、角膜、皮肤、心脏瓣膜、胰岛、部分或全部的脸部、神经 和血管。
[0022] 另一方面，提供此处描述的移植用保存溶液用于限制在细胞切取和移植过程中的 供体细胞损伤。这些细胞可以包括内皮细胞、胰腺细胞、干细胞和免疫细胞。
[0023] 另一方面，提供此处描述的移植用保存溶液用于限制供体器官、供体组织或供体 细胞的离体损伤。
[0024] 在一些实施例中，器官有较大的可能维持器官功能。
[0025] 在一些实施例中，器官可以在身体外保存更长时间。
[0026] 在一些实施例中，该移植用保存溶液在器官切取和移植过程中可用于降低和/或 减少冷缺血和温血再灌注对器官功能、组织功能或细胞功能造成的损伤效应。
[0027] 在一些实施例中，该移植用保存溶液可以在低温下使用。在一些实施例中，该移植 用保存溶液的温度可以在〇到25摄氏度之间。
[0028] 在一些实施例中，该移植用保存溶液的温度可以在0到10摄氏度之间。
[0029] 在一些实施例中，该移植用保存溶液的温度可以在1到6摄氏度之间。
[0030] 在一些实施例中，该移植用保存溶液的温度可以在2到5摄氏度之间。
[0031 ]在一些实施例中，该移植用保存溶液可以在哺乳动物体温下使用。
[0032] 在一些实施例中，该移植用保存溶液的温度可以在25到40摄氏度之间。
[0033]在一些实施例中，该移植用保存溶液的温度可以在29到38摄氏度之间。
[0034]在一些实施例中，该移植用保存溶液的温度可以在35到38摄氏度之间。
[0035] 依照本发明的另一方面，提供治疗器官衰竭病人的方法，该方法包括采购一器官、 在移植用保存溶液中保养、以及将所述的器官移植给病人。
[0036] 在一些实施例中，该器官可以来自于该病人。
[0037] 在一些实施例中，该器官可以来自于不是该病人的另一个人。
[0038] 依照本发明的另一方面，提供治疗患有组织疾病、组织损坏或组织失效的病人的 方法，该方法包括采购组织、在移植用保存溶液中保养、以及将所述的组织移植给病人。
[0039] 在一些实施例中，该组织可以来自于该病人。在一些实施例中，该组织可以来自于 不是该病人的另一个人。
[0040] 依照本发明的另一方面，提供治疗患有细胞疾病、细胞损坏或细胞失效的病人的 方法，该方法包括采购细胞、在移植用保存溶液中保养、以及将所述的细胞移植给病人。 [0041 ] 在一些实施例中，该组织可以来自于该病人。在一些实施例中，该组织可以来自于 不是该病人的另一个人。
[0042] -方面，本发明提供一种配制移植用保存溶液的设备，该设备包括：
[0043] 冻干的聚甘油，其中，该聚甘油的分子量在约0.15kDa至约3.99kDa之间；以及
[0044] 多条指令，用于利用该冻干的聚甘油配制该器官保存溶液。
[0045] 在另一个实施例中，该设备进一步包括一种或多种氨基酸、扩散剂和/或渗透剂。
[0046] 另一方面，本发明提供了一种组合物，包括这里描述的移植用保存溶液和至少一 种生理学可接受的盐、缓冲剂、稀释剂和/或赋形剂，用于限制供体器官、供体组织或供体细 胞的损伤。
[0047] 在一些实施例中，该组合物为水溶液。
[0048] 在另一个实施例中，该组合物为冻干产品。
[0049] 另一个方面，这里描述的移植用保存溶液可以用于向患有器官衰竭或器官疾病的 人移植器官的过程。
[0050] 另一个方面，这里描述的移植用保存溶液可以用于从器官捐献者上切取心脏、肾 脏、肝脏、肺、胰腺、肠、脾、四肢(包括手指/脚趾）、性器官或胸腺的过程。
[0051] 在另一个方面，这里描述的移植用保存溶液可以用于从组织供体者上切取组织的 过程。
[0052]另一个方面，这里描述的移植用保存溶液可以用于从细胞捐献者上切取细胞的过 程。
[0053]依照本发明的另一方面，提供保存移植器官、移植组织或移植活细胞的方法，该方 法包括使器官、组织或细胞与这里描述的移植用保存溶液接触。
【附图说明】
[0054]图1:利用HPG移植用保存溶液保存老鼠心脏，组织损伤较少。该心脏来源于B6鼠， 并于4°C下，在HPG溶液或UW溶液中（0.2mL/器官)存储24h。（A)根据释放在保存溶液中的乳 酸盐脱氢酶(LDH)确定该心脏的组织损伤。数据通过mean土SEM进行呈现。利用双因素方差 分析进行统计分析(P〈〇. 〇〇〇I，HPG对比UW，η = 4-7)。（B)利用HPG溶液或UW溶液进行24小时 冷藏后，心脏切片(经溴化乙锭着色）的典型图像。该心脏在冷藏后用〇.5μg/ml的溴化乙锭 溶液(溴化乙锭的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)溶液)着色15分钟。在用PBS溶液彻底洗涤未附着 的溴化乙锭后，将该心脏横向切成四块。死细胞（已用溴化乙锭着色）的荧光强度在紫外线 条件下测定。
[0055]图2:用HPG溶液冷藏该供体心脏加快了其移植后的功能恢复。供体心脏来源于B6 鼠，并于4°C条件下，在HPG溶液或UW溶液中（0.5mL/器官)存储24h。（A)根据释放在保存溶液 中的乳酸盐脱氢酶(LDH)确定该心脏的组织损伤。得分4:正常收缩(等于〈30分钟在UW溶液 中的冷保存）。在15min时，p〈0.0001 (t检验，HPG对比UW)。在24h时，p〈0.0209(t检验，HPG对 比UW)。
[0056]图3:用HPG溶液冷保存减少心脏移植中的心脏炎症和细胞死亡。用HPG溶液或UW溶 液对供体心脏进行延长的冷保存，并如图2描述的进行移植。移植后24小时获取移植物，并 用福尔马林固定以及用石蜡包埋。（A)用经H&E着色的切片检测移植物损伤。数据通过光学 显微镜的典型图像呈现，显示出血管周炎症和心肌细胞坏死。（B)HPG溶液组对比UW溶液组 的移植物损伤组织学评分。每个组的数据通过mean土 SEM的形式呈现(p = 0.0347, t检验， HPG对比UW，η = 9-10)。（C)通过移植心脏释放至血清中的LDH的量确定移植物损伤。血清是 在移植后24h从受体中获取的，血清LDH作为心脏移植损伤的生化标记物，使用细胞毒性检 测设备进行定量测量。每个组的数据通过十个受体的mean土SEM呈现(P = 0.0381，t检验， HPG对比UW)。
[0057]图4:用HPG溶液冷保存减少髓过氧化物酶(MPO)--心脏移植中的阳性浸润。通过 免疫组织化学染色方法结合抗MPO抗体来测定同系移植心脏切片中的MPO阳性细胞。每个组 的数据通过典型的微观视图呈现=(A)UW组；（B)HPG组；以及(C)阳性对照，血凝块。切片中， 红色箭头指向MPO阳性细胞。（D)使用显微镜在400 X放大倍率(高倍视野或hpf)下统计MPO 阳性浸润物的数目。视图不重叠，并随机挑选。对于每个移植物，统计两个独立部分的至少 25个视图，并求平均值。每个组的数据通过六个移植物的mean土 SEM呈现(p = 0.0287，t检 验，HPG对比UW)。
[0058]图5:用HPG溶液冷保存延长同种异体移植心脏的存活时间。在4°C下，将来自B6小 鼠的供体心脏用HPG溶液和UW溶液（5mL/器官）存储24h，然后移植至同种异体的BALB/c小 鼠，该小鼠每日接受CsA治疗。采用单盲形式，用每日腹式触诊法评估移植物存活时间，移植 物心跳停止将被认为移植物死亡。（A)HPG组对比UW组的移植物的存活时间（p = 0.0175， log-rank检验，11 = 9-10)。（8、〇经H&E着色的的切片(移植后第20天仍正常工作的移植物） 的典型微观视图。
[0059]图6:用HPG溶液冷保存保护人脐静脉内皮细胞免于在低温下细胞溶解。在4°C下， 用HPG溶液或UW溶液将24孔培养板上的单层人脐静脉内皮细胞培养24h: (A)用台盼蓝拒染 法确定细胞存活时间。在每个组中，数据通过四个独立实验的mean土SEM呈现(p = 0.0063，t 检验，HPG对比UW)。（B)通过测定LDH释放量确定相同培养基中的细胞死亡。保存溶液中的 LDH量作为细胞溶解的标记物得到测量，并计算为与相应的阳性对照中总LDH的百分比(UW 溶液含2 %的Tr it on 100)。在每个组中，数据通过四个独立实验的mean 土 SEM呈现（P = 0 · 0002，t检验，HPG对比UW)。
[0060]图7:用HPG溶液冷保存增强人脐静脉内皮细胞在低温下的细胞膜流动性。在4°C 下，利用芘二聚体持续4h检测HPG组或UW组中人脐静脉内皮细胞的细胞膜流动性:计算准分 子与单体的比值(E/Μ)作为在不同的时间点的细胞膜流动性指标。数据通过五个独立实验 的mean土SEM呈现(ρ<0·0001，双因素方差分析，HPG对比UW) 〇 [00611图8:HPG分子量对小鼠心脏冷保存的影响。
【具体实施方式】
[0062] 任何在这里没有直接定义的术语应当被理解为，其具有的通常与其相关的含义为 本发明的技术中理解的含义。
[0063] 这里使用的"聚甘油"的含义为本领域普通技术人员的通常理解，并且通常是指具 有分支度的聚合物，例如，分支度介于〇和1.0之间其中，羟基的数量等于重复元的数量，该 重复单位如下(其中"r"是重复单元）：
[0065]其中，Rl 为H-、CH3-、CH3CH2-、t-Bu-、N3-CH2-CH2、烷基链（I to 18碳）、-〇12-順2、-CH2-N(CH3)2、-CH2-NH(CH3)、r-、r-CH2-〇r(r-)2CH-;R2为-r、-0-r、-0-CH2-CH-r、或-OH;以 及R3为-!1、-〇13、-〇12-〇131-、-〇121或-〇1(1)2。上述重复单元并不仅限于显示的立体构 型。"聚甘油"的实例包括超支化聚甘油(HPG)、线性聚甘油(LPG)或树枝状聚甘油/聚甘油树 形分子或化学改性聚甘油或可生物降解的聚甘油，梳齿状聚甘油或高枝化聚甘油或环状聚 甘油或它们的组合。此处描述的聚甘油的实例包括所有可能的立体结构的替代物，包括那 些这里举例说明的或描述的。
[0066]这里使用的"超支化聚甘油"的含义为本领域普通技术人员的通常理解，并且通常 是指分支度在约〇. 5至约0.7之间的聚甘油。
[0067]这里使用的"线性聚甘油"的含义为本领域普通技术人员的通常理解，并且通常是 指分支度为"〇"的聚甘油。
[0068]这里使用的"树枝状聚甘油/聚甘油树形分子"的含义为本领域普通技术人员的通 常理解，并且通常是指分支度为1.0的聚甘油。
[0069]这里使用的"渗透剂"的含义为本领域普通技术人员的通常理解，并且通常是指穿 过半渗透膜以使水穿过该膜的物质，即创造渗透梯度的物质。
[0070] 这里使用的"扩散剂"的含义为本领域普通技术人员的通常理解，并且通常是指穿 过膜以使溶质从高溶质浓度区域移动至低溶质浓度区域的物质，即创造渗透梯度的物质。
[0071] 这里使用的"电解质"的含义为本领域普通技术人员的通常理解，并且通常是指电 离的溶质。
[0072] 除非另有说明，这里使用的"烷基"（本身或作为另一个取代基的一部分）是指直 链、分枝链或环烃自由基或其组合，它们可以是完全饱和、单一不饱和或多元不饱和的，它 们可以包括二价和多价自由基，它们的碳原子的数目为指定数目（例如，Cl-Cio或1-10元意 思是1-10个碳），或者如果它们的碳原子数目未指定，则其为Cl-Cio烷基。饱和烃自由基的 例子包括，但不限于由甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己 基、（环己基）甲基、环丙烷基氨基、其同系物和同分异构体(例如，正戊基、正己基、正庚基、 正辛基等诸如此类的基团）构成的组。不饱和烷基即该烷基具有一个或多个双键、三键。不 饱和烷基的例子包括但不限于由乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-( 丁间二烯基）、 2，4-戊二烯基、3-( 1，4-戊二烯基）、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基及其高级同系 物和同分异构体组成的组。
[0073] 此处使用的"取代"是指用取代基替代化合物上氢原子。取代基可以是非氢原子取 代基或多原子取代基(至少一个原子为非氢原子和一个或多个可以是也可以不是氢原子）。 例如，但不限于取代化合物可以包含一个或多个化学物质组中的取代基，该化学物质组包 括：R"、OR"、NR"R"、SR"、卤素、SiR〃 R〃' R〃〃、OC (0) R〃、C (0) R〃、C02R〃、C0NR〃 R〃'、NR〃' C (0) 2R〃、S(0)R〃、S(0)2R〃、Cr#PN02.
[0074] 此处使用的R'R"'和R〃〃可以独立地从氢、卤素、氧、取代或未被取代的杂芳基、取 代或未被取代的芳基、取代或未被取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基和芳香基烷基构成的 组中选择。
[0075]这里使用的"移植用保存溶液"的含义为本领域普通技术人员的通常理解，并且通 常是指能够用于在移植过程中减少冷缺血和温血再灌注带给器官或组织的损伤效应。类似 含义的术语包括移植溶液、器官保存溶液、用于移植的保存溶液。一些此项技术中已知的移 植用保存溶液非限制性例子中的一些典型组成包括但不限于UW溶液和HTK溶液。HTK型溶液 为器官保存溶液，其包括组氨酸、色氨酸和酮戊二酸，然而UW型溶液不包括组氨酸、色氨酸 和酮戊二酸。这些类型的器官保存溶液组成的示例如下：

[0082]上面已知器官保存溶液的示例可以用作制备本发明器官保存溶液的基础。在一些 实施例中，本发明的器官保存溶液可以通过在已知的器官保存溶液中添加此处描述的聚甘 油得到。在一些实施例中，除了添加此处描述的聚甘油，还可以对已知器官保存溶液进行改 诰。相比于已知的器官保存溶液，以下是本发明器官保存溶液的一些非眼制件示例。

[0086] 本发明的器官保存溶液不包括乳酸盐。例如，将林格氏乳酸盐溶液用作器官保存 溶液，然而这些实施例包括乳酸盐(其并不被本发明包括）。本发明特定实施例的一个例子 包括此处描述的聚甘油和UW型溶液(不包括棉子糖或羟乙基淀粉)的成份。特定的实施例包 括此处描述的聚甘油和Viaspan?(除了棉子糖和羟乙基淀粉)的组成。
[0087] 更一般地，本发明的移植用保存溶液包括没有典型的乳酸盐的移植用保存溶液 (包含公知的保存溶液），并且进一步包括聚甘油，其中，该聚甘油的分子量在约〇. 15kDa至 约3.99kDa之间，或者分子量在约0.5kDa至约3 . OkDa之间，或者分子量在约0.75kDa至约 2.OkDa之间。聚甘油是柔性的、亲水的脂肪族聚醚，其通过精确控制分子量可以形成线性、 超支化和树枝状形态。聚合物在老鼠体内的循环半衰期通常取决于聚合物的分子量，但是 分子量为540kDa的聚合物的循环半衰期可以达到约60小时。用于本发明的聚甘油可以包含 葡萄糖或碳水化合物，并且在生理PH值条件下稳定且容易传送。
[0088] 超支化聚甘油(HPG)为分支度在约0.5至约0.7之间的聚甘油，其是在缓慢添加单 体的条件下，经由缩水甘油多支化开环聚合制备而成的。聚甘油树状聚合物的制备需经过 多个有机反应。该结构包含具有羟基功能(羟基功能使HPG成为具有强大功能的材料）的大 分支和小分支。线性聚甘油(LPG)可以使用t-BuO-K+作为引发剂，在二氧六环的存在下使乙 氧基乙基缩水甘油醚进行开环聚合，随后在HCl环境下进行去保护反应而制得(Gervais et al·，2010;Kainthan et al·，2006b;Stiriba et al·，2002)。
[0089] 聚甘油是澄清、粘稠的液体。在室温下，其具有高粘性和不易挥发性。线性和超支 化聚甘油在溶液中均具有紧凑特性，并且均极易溶于水（例如，HPG在水中的溶解度高于 200mg/mL)。通过QELS技术测量，Mn等于104，000的LPG在0 · IN的NaN03水溶液中的水力半径 (Rh)为4.55nm。相比之下，Mn为104000的HPG的Rh值为4.85nm，而分子量类似的PEG的Rh值为 12.23nm。与其它水溶性线性高分子相比，LPG非常小的Rh值表明其具有相当不同的溶液结 构，并且可能与HPG的溶液结构和性质更接近。在特性粘度方面，LPG的特性粘度(0.047dL/ g)更类似于HPG(0.052dL/g)，而不是PEG(1.308dL/g)，这表明LPG在溶液中具有高度紧凑的 结构。聚甘油的特性粘度随着分子量的增加而增加(类似于蛋白质），并明显低于其他线性 聚合物。
[0090] 本发明的移植用保存溶液的pH值在约2.0至约9.0之间，或者在约6.5至约7.5之 间。
[0091 ]本发明的移植用保存溶液为水溶液，其中，该聚甘油占溶液重量的约0.01 %至约 50 %，或者占溶液重量的约1.25%至约20%。例如，浓度为1.25wt. %的0.5kDa分子量的HPG 至浓度为20wt. %的3.99kDa分子量的HPG。
[0092] 本发明的移植用保存溶液的渗透压浓度在约ISOmOsm/!至约1500m0sm/L之间。对 于器官移植的应用，渗透压浓度可以在约290m0sm/L至约450m0sm/L之间。对于体外的应用， 高渗透压浓度可以使用；例如，浓度为约40wt. %至约50wt. %的0.5kDa分子量的HPG溶液可 以达到1500m0sm/L的渗透压浓度。由于HPG的分子量较低，浓度为约30wt. %至约40wt. %的 HPG溶液可以达到这样的渗透压浓度。
[0093] 本发明的移植用保存溶液的多分散指数在约1.0至约15之间。
[0094] 在一些实施例中，本发明的移植用保存溶液可以包括至少两种聚甘油，其中，该至 少两种聚甘油中的每一种的分子量均不相同。该至少两种聚甘油中的每种的分子量的变化 尽可能小于74Da，对应于一个重复单位的近似重量。分子量也会随数量变化，如0.5kDa、约 IkDa 或约 2kDa。
[0095] 在一些实施例中，本发明的移植用保存溶液包括单一分子量的聚甘油。在一些实 施例中，该移植用保存溶液仅包括一种聚甘油，在另一些实施例中，该移植用保存溶液包括 至少两种分子量相同、化学结构不同的聚甘油。
[0096] 此处描述的聚甘油可以被衍生化。聚甘油的衍生物包含具有一个或多个疏水基 团、一个或多个亲水基团，或者两者兼具的聚合物。这些区域可以通过对聚合物的羟基进行 衍生化得到。功能性衍生基团可以与聚甘油上约1%至约100%的羟基连接，或者与聚甘油 上约1%至约40%的羟基连接。聚甘油包含这些基团导致聚甘油中羟基的数量不再等于重 复单元的数量。在聚甘油上添加这些基团的方法是本领域普通技术人员所熟知的 (Beaudette et al.,2011；Calderon et al.,2010；Dernedde et al.,2010；Kainthan et al.,2006a；Kainthan et al.,2008；Kizhakkedathu et al.,2010；Turk et al.,2004； Wilms et al.，2010)。疏水基团和亲水基团的例子包括羧酸、胺、取代胺、氨基酸、磷酸、硫 酸、烷基、烷基醚、芳基、两性基团、糖类、二硫化物或硫醇。
[0097] 此处描述的移植用保存溶液可以进一步包括一种或多种电解质、一种或多种氨基 酸，一种或多种扩散剂、一种或多种的抗氧化剂、一种或多种生长因子、一种或多种缓冲剂、 一种或多种抗细胞凋亡剂和/或一种或多种渗透剂。该扩散剂或该渗透剂可以包括钠、氯化 物、硫酸盐、磷酸盐、钙、钾、镁、乳糖醛酸盐、葡萄糖、右旋糖、果糖、甘油、山梨醇、甘露醇、左 旋肉碱、牛血清白蛋白、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖、木糖醇、腺苷、谷胱甘肽、乳糖醛酸、氢 氧化钾或其混合物。该缓冲剂可以包括顺丁烯二酸、磷酸、硫酸盐、碳酸盐、柠檬酸、苹果酸、 甲酸、乳酸、琥珀酸、醋酸、特戊酸、吡啶、哌嗪、吡啶甲酸、组氨酸、3-(N-吗啉代）丙磺酸 (MOPS )、4- (2-羟乙基)-1 -哌嗪乙烷磺酸(HEPES )、三羟甲基甲基甘氨酸、二羟基二合银、N-二甘氨酸、硼酸、甘氨酸或其混合物。
[0098] 此处描述的移植用保存溶液可以用于器官移植过程。该器官移植可以实施于哺乳 动物。
[0099] 在低温保存供体器官的过程中，冷缺血损伤加上复温或再灌注带来的额外损伤较 大程度要归因于刚移植后弱的器官功能以及随后的排斥反应(Garlicki，2003 et al.，2008;LauZurica et al.，2008)。移植用保存溶液可以增强对捐献器官的保护，避免其 经受冷缺血损伤，并增强对人内皮细胞的保护，避免其经受冷诱发细胞死亡。
[0100] 在器官切取和运输的过程，低温(0-5°C)存储和运输供体器官导致有氧代谢停止， 并避免了热缺血性损伤。在临床实践中，使用移植用保存溶液可能是一种延长贮藏期限的 有效方法，并且在冷缺血性存储过程中，使用器官保存溶液作为低温保存溶液可以防止细 胞肿胀。
[0101] 移植后，保持内皮细胞活力或内皮单层完整性有助于顺利限制固体器官的血管渗 透性。当为了移植之前的冷保存，而用冷保存溶液替换供体器官内的血液时，血管内皮通常 首先与冷环境接触。在各种器官移植过程中，内皮完整性的丧失通常代表冷保存相关移植 损伤的重要事件。冷损伤可能会损害内皮的屏障功能，导致薄壁组织水肿和出血(在再灌注 之前）以及早期移植物功能异常。本发明的移植用保存溶液可以提高对培养的内皮细胞的 保护以避免其坏死，并可以减少移植物冷保存期间的损伤。使用本发明的移植用保存溶液， 可以在移植后观察到功能恢复加快、血管周围炎症减少、细胞浸润减少以及移植物存活时 间延长。
[0102] 细胞膜是冷诱发损伤存在的地方。当细胞转移到低温下后，细胞膜可能会丧失稳 定性(例如，由于膜结构的改变）。例子包括:改变特定的油脂-蛋白质相互作用、磷脂不对称 性和油脂组成。膜由液晶态转变为凝胶态会导致细胞死亡。冷的移植用保存溶液可以防止 这种转变以及其他冷诱发损伤。
[0103] 本发明的移植用保存溶液可以包含于用于配制移植用保存溶液的设备中。该设备 可以包括此处描述的冻干聚甘油和使用该冻干聚甘油配制移植用保存溶液的若干指令。该 设备可以包括该移植用保存溶液的其它成份，包含电解质、氨基酸、一种或多种其它扩散剂 和/或一种或多种其它渗透剂。
[0104] 此处描述的移植用保存溶液可以包含于一种组合物中。该组合物包括此处描述的 HPG和至少一种生理学可接受的盐、缓冲剂、稀释剂或赋形剂，以用作移植用保存溶液。该组 合物为水溶液或冻干产品。
[0105] 此处描述了各种可供选择的实施例和例子。这些实施例和示例起说明作用，并不 会限定本发明的范围。
[0106] 示例
[0107] 从Jackson Laboratory(Bar Harboi^MEWSAW^^^CSTBL/GjUBG^PBALB/c^、 (雄性，8-10周龄）。在本研究中，与动物使用相关的所有的程序均依照拿大动物保护协会准 贝IJ(基于经位于英属哥伦比亚大学的动物使用委员会批准的协定)执行和监控。主要的人脐 静脉内皮细胞（HUVECs)购至Lonza Walkersville Inc(Walkersvilie ,MD ,USA)，并利用我 们实验室用于实验的原始缺陷性SV40DNA进行永生化。内皮细胞在37 °C、5 %二氧化碳环境 下，用Medium 199进行维护和培养，Medium 199中还添加有10%的小牛血清、血管内皮细胞 生长补充剂、50μg/ml的肝素以及抗生素(青霉素和链霉素）（Sigma-Aldrich，St. Louis ,MO， USA) 〇
[0108] 数据通过mean土SEM进行呈现。两个组间差异的统计学显著性由t检验决定。使用 单因素方差分析(ANOVA)或双因素方差分析及图基多重比较检验，由于其合适多个组的比 较。p<0.05时被认为具有统计学显著性。
[0109] 示例1:利用HPG溶液冷保存分离的心脏减少组织损伤
[0110]通过在不同的时间点测定供体组织的LDH释放量来比较用HPG溶液保存离体小鼠 心脏产生的损伤与用UW溶液保存离体小鼠心脏产生的损伤，以显示供体器官冷存储过程中 HPG溶液相比于UW溶液(0.2mL/器官，4°C)在防止冷缺血损伤方面的有益作用。如图IA所示， 在UW溶液和HPG溶液中的冷存储时间越长，上层清液中器官的受损组织或坏死细胞释放的 LDH的量越多，但HPG溶液中LDH的量显著低于UW溶液中的量。相比于UW组中LDH的量从2h的 1.15±0.22增加到24h的2.46 ±0.24,在HPG组中，LDH的量从2h的0.75 ±0.43增加到24h的 1.71±0.55(?〈0.0001，双因素方差分析，11 = 4-7)。相比于冊组，册6组中心脏更少的0)!1释 放量表明其对器官的保护更强，这将进一步由溴化乙锭(EB)着色实验所证实（图1B)。溴化 乙锭(使核酸着色)是不能透过细胞膜的荧光染料，并已用于死细胞着色。如图IB所示，24h 后，HPG溶液中经EB着色的心脏的强度弱于存储在UW溶液中的心脏。这些数据表明，相比于 UW溶液，在HPG溶液中冷存储的离体小鼠心脏的损伤更少。 示例2:在用HPG溶液冷存储后，在同系受体内的心脏的功能恢复加快，且组织损伤 较少
[0112]为了进一步检查HPG溶液对捐献器官增强的保护作用是否能够转化为移植后功能 恢复能力，将用HPG溶液(5mL/器官)在4°C下冷藏24小时的B6小鼠的心脏异位移植至同系的 B6小鼠。对存储于UW溶液中的心脏实施类似的实验。在手术后15min和24h时均检查移植物 的功能。如图2所示，在两个时间点，经HPG溶液预处理的移植心脏的移植物功能临床评分均 明显高于经UW溶液预处理的心脏。在15min(P〈0.0001)时，相比于UW溶液组2.292的平均评 分，HPG溶液组的平均评分为3.542，在24h时，相比于UW溶液组(P = 0.0 209)2.833的平均评 分，HPG溶液组的平均评分为3.833。对于UW溶液组，12个移植物中有2个在24h时丧失功能。 这些数据表明，移植后，相比于UW溶液，经过HPG溶液冷保存较长时间后，供体心脏具有更好 的功能恢复能力。
[0113]为了进一步理解为什么保存在HPG溶液中的移植物具有更好的功能恢复能力，所 以在移植后的24小时检查移植心脏的组织损伤和中性粒细胞浸润。用H&E染色剂对移植心 脏的切片进行着色表明，相比于用UW溶液存储移植物，用HPG溶液存储的心脏展示出较少的 血管周炎症和心肌细胞坏死（图3A)。该结果被半定量评分法所证实（图3B)，其表明，相比于 UW溶液组(P = O.0347)的2.0±0.258,HPG溶液组的得分（I. 111 ±0.423)明显更低。经组织 学分析，较少的组织损伤进一步由受体小鼠（接受用HPG溶液保存的移植物)较低的血清LDH 量所证实。图3C显示，测量中血清LDH的量由吸光度值表征，在受体中，HPG组的吸光度值为 1.21±0.76，明显低于1^组的1.97±1.34(口 = 0.0381)。
[0114] 中性粒细胞是在创伤后几分钟内作出第一时间反应的炎症细胞(补充到受伤部 位），并且是急性肌肉损伤的标志（Tidball JG，1995)。心脏切片中的MPO表达浸润(激活的 中性粒细胞)通过免疫组织化学染色方法结合抗MPO抗体来测定，并用半定量方法计数。如 图4所示，MPO +浸润的免疫组织化学染色实验显示，相比于UW溶液组(6.237 ± 0.921细胞/ hpf) (p = 0.0287，η = 6)，HPG溶液组的移植物切片具有较少的浸润MPO+细胞(3.712±0.615 细胞Apf )。综上所述，所有这些数据表明，用HPG溶液冷保存供体心脏可以改善移植后移植 物功能的恢复能力，这与较少的移植物损伤相关联。
[0115] 示例3:用HPG溶液冷存储后，延长了移植心脏的存活时间
[0116] 在临床移植过程中，供体器官大多移植至同种异体的受体内，而这些同种异体移 植物需在免疫抑制治疗下存活。为了测试在这种条件下HPG溶液是否优于UW溶液，在4°C下， 将来自B6小鼠的供体心脏用HPG溶液和UW溶液(5mL/器官)保存24h。将存储的心脏移植到异 位移植至同种异体的BALB/c小鼠，该小鼠在手术后每日接受CsA治疗。如图5所示，相比于UW 溶液，保存在HPG溶液中的同种异体移植物的存活时间更长。UW溶液组中，只有一个移植物 存活了3天，其余的移植物存活时间均在24h内。相比之下，在HPG组中，三个移植物在用CsA 治疗的受体内存活至实验结束(20天）(P = 0.0175,时序检验)并保持其功能，而九个移植物 中的四个在24h内死亡。这些数据表明，用HPG溶液冷保存供体器官能够延长移植物在同种 异体受体内的存活时间。
[0117] 示例4:在低温条件下，接触HPG溶液的培养的人内皮细胞的细胞生存能力增强
[0118] 为了进一步测试HPG溶液在冷保存供体器官对UW溶液的优势，比较了这两种溶液 在4°C下对培养的人脐静脉内皮细胞生存能力的影响。如图6所示，相比于UW溶液，与HPG溶 液接触的培养的人脐静脉内皮细胞的存活数量更多，证据是，相比于UW溶液（20.75 ± 2.87 % )，经HPG溶液(40.19 ± 3.77 % )(P = 0.0063)处理的人脐静脉内皮细胞中细胞存活数 量明显更多（图7A)。相比于UW溶液(43.46±2·6%) (P = O.0002)，HPG溶液（21.76±0.29%) 中LDH释放量更少，进一步证实了 HPG溶液对细胞生存的有益作用。在正常培养条件下培养 24h后，人脐静脉内皮细胞释放的LDH的量大约是21 %，这表明在低温下，HPG溶液在24h内可 能完整地保护培养的内皮细胞免于细胞溶解。
[0119] 示例5:用HPG溶液冷保存可维持细胞膜的流动性和细胞内ATP
[0120] 为了探究HPG溶液在避免低温保护培养的人脐静脉内皮细胞免于死亡方面的相对 于UW溶液存在优势的原因，对两者给膜流动性和细胞内ATP的影响进行了考察。通过芘二聚 体形成反应(使用芘二聚体形成探针和芘癸酸)来测定细胞膜流动性。如图7所示，在人脐静 脉内皮细胞与UW溶液冷接触后，E/Μ比呈下降趋势，从Oh的0.99 ± 0.02下降至4h的0.85 土 0.07 (P = 0.1887，单因素方差分析，η = 3)。然而，这些细胞在HPG溶液中的E/Μ比在研究时期 (4h)内保持不变，由Oh的1.04±0.07至4h的1.10±0.1 (P = O.4647,单因素方差分析，η = 3)。各组间E/Μ比的统计比较表明，相比于UW溶液，HPG溶液中的人脐静脉内皮细胞的E/Μ比 明显更高(Ρ〈〇.0001，双因素方差分析）。这些数据表明，即使在低温下，HPG溶液能够保持培 养的内皮细胞的膜流动性，然而在用UW溶液冷保存时，细胞的膜流动性降低。
[0121] 为了证实这个观察结果，将这些细胞在UW溶液和HPG溶液中冷保存4h后，测量细胞 外和细胞内的ATP水平。如表1所示，在与冷UW溶液和冷HPG溶液接触后，人脐静脉内皮细胞 释放的细胞外 ATP 没有明显不同（137.14±2(hllpmoU^tl30.04±18.19pmol，P=18.19)， 而与用UW溶液(43.0 ± 4.4pmoI) (P = 0.0208)保存相比，用HPG溶液保存的人脐静脉内皮细 胞的细胞内ATP(50·67±4·03pmo 1)明显更高（43·0±4·4pmo 1)，这进一步支持了HPG溶液组 中的细胞外ATP与细胞内ATP的比值明显低于UW溶液组中的比值（2.55 ± 0.17对比3.18 土 0.31，P = 0.31)的事实。综上所述，相比于UW溶液，用HPG溶液低温保存人内皮细胞能增强细 胞生存能力(与维持膜流动性的能力和ATP生物合成能力呈正相关）。
[0122] 示例6:制备HPG溶液
[0123] 如前所述，HPG聚合物(0.5、l、0.5kDa)是通过缩水甘油进行阴离子开环多分支聚 合而合成的（Sunder et al.，1999)。.聚合物的分子特性通过凝胶渗透色谱法和质子核磁 共振谱法测定。HPG用Mi 11 iQ过滤水透析并冻干。HPG基保存溶液通过将HPG(3 %，w/v)溶解 在包含了 IOOmM的乳糖醛酸、IOOmM的氢氧化钾(KOH)、25mM的磷酸二氢钾(KH2P04)、5mM的硫 酸镁(MgS04)、5mM的腺苷、3mM的谷胱甘肽及ImM的别嘌呤醇的溶液中而制得，该溶液即与删 除了3〇!1^的棉子糖和5%的羟乙基淀粉后的￥丨 &8?&1^冊溶液（冊8〇11^丨011，〇1^01^ 〇已1^(^，]\^88丨883耶3，(^，〇31^(13)的成份相同。在22°(^下，使用似0!1/]^1将]^ ：)6保存溶液的 pH调节至7.4，并且使用温哥华沿海健康区域的医疗实验室（Vancouver，BC，Canada)的 .Advancecl?Model 3320微型渗压仪（Advanced Instruments, Inc. ,Norwood, MA, USA)测定 渗透压浓度(~320m0sm/kg)。
[0124] 示例7:供体器官保存及异位心脏移植
[0125] 在给B6供体小鼠注射lOunits/mL的肝素后，从其获取供体心脏，并在4°C下以结扎 肺静脉的状态存储在HPG溶液和UW溶液中。在冷保存24小时后，供体心脏被异位培养移植至 如前所述的同系B6小鼠（同系移植)或同种异体的BALB/c小鼠（同种异体移植）（Li et al.， 2011)。按照如前所述的半定量方法，根据移植物移植后15min和24h的收缩或跳动来对移植 物功能进行评分(Kuznetsov et al.，2004;Li et al. ,2011)。在同种异体移植过程中，受 体小鼠在手术后立即接受CsA治疗（15mg/kg/day,Novartis ,Basel ,Switzerland)直到结束 实验或持续20天。采用单盲形式，用每日腹式触诊法评估移植物存活能力。心跳停止表示心 脏移植失败，并通过随后的组织学检查确认。
[0126] 示例8:乳酸脱氢酶(LDH)的测定
[0127] 细胞死亡伴随着细胞膜破坏和/或心脏损伤（由LDH释放量确定），LDH释放量是按 照厂家规程，利用细胞毒性检测设备(Roche Applied Science ,Laval，QC)采用LDH法测定 的。在培养的细胞中，保存溶液中的LDH释放量通过阳性对照（用2 %的Triton X-100来培育 细胞)的百分比呈现，或者在小鼠中，血清中的LDH释放量通过吸光度单位(0D490)呈现。
[0128] 示例9:用台盼蓝拒染法来半定量细胞活力
[0129] 利用台盼蓝(不能渗透细胞膜的染料)进行负染来评估细胞活力。简而言之，融合 的单层人脐静脉内皮细胞(0.2 X IO6细胞/孔)在24-孔细胞培养板上培养一晚，然后在4°C 下用0.5mL的HPG溶液或UW溶液培养。冷保存24小时后，用trypin-EDTA溶液(Sigma-Aldrich Canada)将细胞洗脱，并将有活力的、存活的细胞用台盼蓝负染，这些细胞通过TC10TM自动 细胞计数器（Bio-Rad Laboratories Canada ,Mississauga，0N，Canada)进行自动统计。存 活细胞百分比的计算如下：％ = (TX/TQ) X 100,其中，Tx代表指定时间点的活细胞总数，T0表 示未处理的细胞单层中的活细胞总数(Oh时间点）。每个样品中的活细胞的数量由至少三个 决定簇的平均值表示。
[0130] 示例10:评估细胞膜流动性
[0131 ]根据厂商规程(Marker Gene Technologies ,Eugene，0R，USA)，用膜流动性设备测 量培养的人脐静脉内皮细胞的细胞膜流动性。
[0132] 培养基内的人脐静脉内皮细胞（IX IO6细胞/ml)用脂质模拟探针芘癸酸进行标 记，其通过在25 °C下培养20分钟进行标记。在用PBS洗涤两次后，将这些细胞在4 °C下培养在 HPG溶液或UW溶液内。在340nm的激发光下，使用荧光谱仪在4°C下持续6h检测探针中单体 (M)的390nm发射光或二聚体(E)的480nm发送光。计算E/Μ值作为膜流动性的指标。
[0133] 示例11:免疫组织化学分析。
[0134] 利用标准免疫组织化学方法对心脏组织切片中的髓过氧化物酶(MPO)(浸润性中 性粒细胞的生物标志物）进行定位，而通过前述的方法对M P 0+浸润进行半定量。（G u a n e t al.，2012;Li et al.，2011)。
[0135] 示例12:测量三磷酸腺苷
[0136] 根据厂商规程，利用ATP测定设备测定溶液或细胞提取物中三磷酸腺苷(ATP)的量 (Invitrogen-Life Technologies Inc.，Burlington，0N，Canada) 〇简而言之，将人脐静脉 内皮细胞（I X 106细胞/孔)在6-孔细胞培养板上的培养基中培养一晚，然后在4°C下与HPG 溶液或UW溶液(0.5mL/孔)接触4h。在收集溶液/上层清液后，通过使用0.35mL/孔的体细胞 ATP的释放剂（Sigma-Aldrich Canada)培养细胞来提取细胞内ATP。在每个实验中，上层清 液中的细胞外ATP和细胞内ATP的量基于ATP标准(在相同实验中测定)进行计算。
[0137] 示例13:移植物损伤的组织学分析
[0138] 在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌注后，组织样本在剖检中移除，并固定在10%的缓冲 甲醛。然后将样本嵌入石蜡中，并在切片后用于苏木精-伊红染色。利用组织学分析确定H&E 着色切片中的移植物损伤，并采用单盲形式，基于心脏组织损伤的严重性对移植物损伤进 行病理学评分，根据微观观察::正常的心脏组织；1:轻度的损伤，表明血管周损伤;2:严重 损伤，表明血管周损伤和轻度的心脏出血;或3:严重出血和心脏膨胀。
[0139] 示例14: HPG分子量对小鼠心脏冷保存的影响
[0140] 使用与示例子1类似的规程，实施测试HPG分子量对小鼠心脏冷保存影响的实验。 本实验的结果列在表中，并进一步列在图8中。
[0142] *所有的HPG溶液包含浓度为3% (w/v)的HPG。
[0143] **在4 °C下保存6或24h后，小鼠心脏损伤通过LDH的释放量测定，并且通过LDH测量 中的吸光度形式呈现。
[0144] 通过双因素方差法(η = 3)统计分析UW溶液与每种HPG溶液的差别。p<0.05时 被认为具有统计学显著性。
[0145] 虽然本发明的各种实施例在此处披露，但是根据本领域技术人员普通的常识可以 在本发明的范围内作出许多改编和修改。这样的修改包括对本发明任何方面进行的已知等 价物替代，以用实质上相同的方式得到相同的结果。数值范围包括限定范围的数值。进一 步，提供数值范围以便陈述值的范围，除了陈述范围内的单独的值被特别陈述不在该范围 内之外。在此使用的词汇"包括"为可扩充词语，实质上相当于短语"包含，但不限于"，并且 词汇"构成"具有相同的含义。在此处使用的单数形式"一个"、"这个"包含复数的引用，除非 上下文清楚地指定其它方面。因此，例如，提及的"一个事物"包括超过不只一个这样的事 物。此处引用的参考文献并不是承认这样的参考文献是本发明的现有技术。此外，说明书背 景部分中出现的材料并不是承认这样的材料是本发明的现有技术。任何优先权文件在这里 被纳入作为参考，就像每个被特别地和单独地指明的纳入作参考的单独的优先权文件以及 在这里充分阐述的。本发明包括所有的实施例和变化，大体上如此处之前描述的和参考的 示例和附图。
[0146] 此处引用的参考文献并不是承认这样的参考文献是本发明的现有技术，也不构成 承认关于这些文件的内容或日期。
[0147] 参考文献
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【主权项】
1. 一种器官保存溶液，包括聚甘油，其中，该聚甘油的分子量在约0.15kDa至约3.99kDa 之间。2. -种器官保存溶液，包括UW器官保存溶液和聚甘油，其中，该聚甘油的分子量在约 0.15kDa至约 3.99kDa之间。3. 如权利要求1或2所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油的分子量在约0.48kDa至约 3. OkDa之间。4. 如权利要求1-2任一所述的器官保存溶液，其中，该器官保存溶液的pH在约2.0至约 9.0之间。5. 如权利要求1-4任一所述的器官保存溶液，其中，该器官保存溶液的pH在约6.5至约 7.5之间。6. 如权利要求1-5任一所述的器官保存溶液，其中，该器官保存溶液为水溶液。7. 如权利要求6所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油占该器官保存溶液重量的约 0.01%至约 50%。8. 如权利要求6或7所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油占该器官保存溶液重量的约 1.25%至约 20%。9. 如权利要求1-8任一所述的器官保存溶液，其中，该器官保存溶液的渗透压浓度在约 150m0sm/L 至约 1500m0sm/L之间。10. 如权利要求1-9任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油的多分散指数在约1.0至 约15之间。11. 如权利要求1-10任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油呈树枝状。12. 如权利要求1-10任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油的分支度在约0至约0.4 之间。13. 如权利要求1-10任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油的分支度在约0.4至约 0.7之间。14. 如权利要求1-10任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油的分支度在约0.7至约 1.0之间。15. 如权利要求1-10任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油的分支度为0。16. 如权利要求1-15任一所述的器官保存溶液，包括至少两种聚甘油，其中，该至少两 种聚甘油中的每一种的分子量均不相同。17. 如权利要求1-16任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油还包括一个或多个疏水 基团、一个或多个亲水基团，或者两者兼具。18. 如权利要求17所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油约1%至约100%的羟基上连接 有一个或多个疏水基团、一个或多个亲水基团，或者前两者兼具。19. 如权利要求17或18任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油约1 %至约40%的羟 基上连接有一个或多个疏水基团、一个或多个亲水基团，或者前两者兼具。20. 如权利要求17至19所述的器官保存溶液，一个或多个疏水基团、一个或多个亲水基 团或者前两者兼具包括羧酸、氨基、取代氨基、季胺基、氨基酸、磷酸、硫酸、磺酸、膦酸酯、烷 基、烯烃、炔烃、烷基醚、芳香化合物、芳醚、两性基团、糖类、二硫化物、缩酮、取代缩酮、乙缩 醛、取代缩醛、酯基、硫酯、尿烷、酯酰胺、酰胺基、肽、苯酚、卤素或硫醇中的一个或多个。21. 如权利要求1-20任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种电解质。22. 如权利要求1-21任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种黄嘌呤氧化酶抑制 剂。23. 如权利要求1-22任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种抗氧化剂。24. 如权利要求1-23任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种核苷。25. 如权利要求1-24任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种氨基酸。26. 如权利要求1-25任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种扩散剂。27. 如权利要求1-26任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种渗透剂。28. 如权利要求1-27任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种生长因子。29. 如权利要求1-27任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种缓冲剂。30. 如权利要求1-27任一所述的器官保存溶液，还包括一种或多种抗细胞凋亡剂。31. 如权利要求26或27所述的器官保存溶液，其中，渗透剂或扩散剂的至少选自以下化 学物质组中的一种，该化学物质组包含:钠、氯化物、硫酸盐、磷酸盐、钙、钾、镁、乳糖醛酸 盐、葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、甘露醇、左旋肉碱、牛血清白蛋白、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽 五糖、木糖醇、腺苷、谷胱甘肽、乳糖酸、氢氧化钾、合成聚合物和天然聚合物。32. 如权利要求26或27所述的器官保存溶液，其中，该渗透剂包括乳糖醛酸盐。33. 如权利要求29所述的器官保存溶液，其中，该缓冲剂选自以下化学物质组中的至少 一种，该化学物质组包含:顺丁烯二酸、磷酸、硫酸盐、碳酸盐、柠檬酸、苹果酸、甲酸、乳酸、 琥珀酸、醋酸、特戊酸、吡啶、哌嗪、吡啶甲酸、组氨酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸、三羟甲基甲基甘氨酸、二羟基二合银、N-二甘氨酸、硼酸和甘氨酸。34. 如权利要求1-33任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油包括超支化聚甘油。35. 如权利要求1-34任一所述的器官保存溶液，其中，该聚甘油包括线性聚甘油。36. -种如权利要求1-35任一所述的器官保存溶液的用途，用于保存器官。37. -种如权利要求1-35任一所述的器官保存溶液的用途，用于运输器官。38. -种如权利要求1-35任一所述的器官保存溶液的用途，用于运输身体组织。39. -种如权利要求1-35任一所述的器官保存溶液的用途，用于运输细胞。40. 如权利要求36-39任一所述的器官保存溶液的用途，身体组织或细胞实行离体运 输。41. 一种如权利要求1-35任一所述的器官保存溶液的用途，用于防止或减少器官、身体 组织或细胞内的冷缺血。42. -种如权利要求1-35任一所述的器官保存溶液的用途，用于防止或减少器官、身体 组织和细胞上源于温血再灌注的有害效应。43. -种治疗需要器官移植的病人的方法，包括:将权利要求1-35任一所述的器官保存 溶液提供给供体器官，运输该供体器官和移植该供体器官。44. 一种治疗需要器官移植的病人的方法，包括:将权利要求1-35任一所述的器官保存 溶液运用于供体组织，运输该供体组织和移植该供体组织。45. -种治疗需要器官移植的病人的方法，包括:将权利要求1-35任一所述的器官保存 溶液运用于供体细胞，运输该供体细胞和移植该供体细胞。46. 如权利要求43-45任一所述的方法，其中，该器官保存溶液每天被运用超过一次。47. -种配制器官保存溶液的设备，该设备包括： (a) 冻干的聚甘油，其中，该聚甘油的分子量在约0.15kDa至约3.99kDa之间；以及 (b) 多条指令，用于利用该冻干的聚甘油配制该器官保存溶液。48. 如权利要求47所述的设备，其中，该设备用于配制UW器官保存溶液。49. 如权利要求47或48所述的设备，其中，该聚甘油的分子量在约0.48kDa至约 3. OkDa之间。50. 如权利要求47-49任一所述的设备，还包括一种或多种电解质。51. 如权利要求47-50任一所述的设备，还包括一种或多种氨基酸。52. 如权利要求47-51任一所述的设备，还包括一种或多种黄嘌呤氧化酶抑制剂。53. 如权利要求47-52任一所述的设备，还包括一种或多种抗氧化剂。54. 如权利要求47-53任一所述的设备，还包括一种或多种核苷。55. 如权利要求47-54任一所述的设备，还包括一种或多种生长因子。56. 如权利要求47-55任一所述的设备，还包括一种或多种缓冲剂。57. 如权利要求47-56任一所述的设备，还包括一种或多种抗细胞凋亡剂。58. 如权利要求47-57任一所述的设备，还包括一种或多种扩散剂。59. 如权利要求47-58任一所述的设备，还包括一种或多种渗透剂。60. 如权利要求58或59所述的设备，其中，该渗透剂或扩散剂选自以下化学物质组中的 至少一种，该化学物质组包含:钠、氯化物、硫酸盐、磷酸盐、钙、钾、镁、乳糖醛酸盐、葡萄糖、 果糖、甘油、山梨醇、甘露醇、左旋肉碱、牛血清白蛋白、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖、木糖 醇、腺苷、谷胱甘肽、乳糖酸、氢氧化钾、合成聚合物和天然聚合物。61. 如权利要求58或59所述的设备，其中，该渗透剂包括乳糖醛酸盐。62. 如权利要求56所述的设备，其中，该缓冲剂选自化学物质组中的至少一种，该化学 物质组包含:顺丁烯二酸、磷酸、硫酸盐、碳酸盐、柠檬酸、苹果酸、甲酸、乳酸、琥珀酸、醋酸、 特戊酸、啦啶、哌嗪、啦啶甲酸、组氨酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺 酸、三羟甲基甲基甘氨酸、二羟基二合银、N-二甘氨酸、硼酸和甘氨酸。63. -种组合物，包括如权利要求1-35任一所述的器官保存溶液和至少一种生理学可 接受的盐、缓冲剂、稀释剂或赋形剂，以用作器官保存溶液。64. 如权利要求63所述的组合物，其中，该组合物为水溶液。65. 如权利要求64所述的组合物，其中，该组合物为冻干产品。
【文档编号】A01N1/02GK105960165SQ201480072964
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年11月21日
【发明人】捷亚成哲.克瓦肯德杜, 杜才干, 唐纳德.布鲁克斯, 阮以壯
【申请人】英属哥伦比亚大学