用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液及其在乳腺组织冻存方法中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液，是由胎牛血清FBS、DMEM/F12培养基、二甲基亚砜DMSO和HEPES缓冲液复配丙酮酸钠的贮存液按体积比20：12：5：3的比例配制的；并提供了冻存液在奶牛乳腺组织冻存方法中的应用。本发明的有益效果为：本发明提供的一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液及其在奶牛乳腺组织冻存方法中的应用，能够减少频繁取材的麻烦，降低取材成本；大大简化组织块剪切、清洗、冻存和复苏等操作过程，有利于保持组织块生物活性，可有效保存6～8个月。
【专利说明】
用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液及其 在乳腺组织冻存方法中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及组织与细胞工程技术领域，具体涉及用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养 的奶牛乳腺组织冻存液及其在乳腺组织冻存方法中的应用。
【背景技术】
[0002] 组织冻存技术目前在遗传育种、生物医疗领域已得到广泛应用，不仅可以保存稀 缺组织，同时可以减少某些研究需要反复取材麻烦。但是不同的用途决定了不同组织的采 用不同的冻存方式。组织标本离体后应及时4°C保存或依不同的实验目的，在30 min内或 在更短的时间内进行取材、固定或冻存。王璇(2013)研究了不同组织冻存体系对牙周膜干 细胞体外扩增的影响。
[0003] 冻存组织标本有人采用-70°C无水乙醇冻存法，即在-70°C冰箱内事先放入无 水乙醇预冷，组织取材后装入塑料袋内，封口器封口，置冷无水乙醇中速冻3~4 min后取 出，滤纸吸干塑料袋表面的无水乙醇，放入-70°C低温冰箱内长期保存。但奶牛乳腺组织是 培养乳腺上皮细胞的主要材料，但组织品质好、无污染的奶牛乳腺组织获取成本高。为了有 效的开展奶牛乳腺上皮细胞原代培养的工作，对奶牛乳腺组织块冻存技术进行了探索，成 功建立了冻存乳腺组织分离培养奶牛乳腺上皮细胞的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于奶牛乳腺上皮细 胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液及其在奶牛乳腺组织冻存方法中的应用。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代 培养的奶牛乳腺组织冻存液，是由胎牛血清FBS、DMEM/F12培养基、二甲基亚砜DMS0和HEPES 缓冲液复配丙酮酸钠的贮存液按体积比20:12:5:3的比例配制的。
[0006] 进一步的，上述的一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液， 所述HEPES缓冲液复配丙酮酸钠的贮存液的配制方法为:准确称取HEPES 0.9532g、丙酮酸 钠 0.1100g，溶解于30mL D-Hank ' s基础培养基中，充分溶解并混合均匀，定容至50mL，经过 0.22微米微孔滤膜过滤后，避光4°C密封保存备用，该贮存液不宜长时间保存，现配现用； 其中，HEPES缓冲液的含量为0.8mol/L、丙酮酸钠的含量为0.02 mol/L。
[0007] 进一步的，上述的一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液， 所述DMEM/F12培养基和二甲基亚砜DMS0均需经过0.22 μπι微孔滤膜过滤除菌，现配现用。
[0008] 本发明的第二个目的是提供了上述一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛 乳腺组织冻存液在奶牛乳腺组织冻存方法中的应用，是将乳腺中部组织剪成体积为4~ 5_3大小的组织块，放入5mL冻存管，每支冻存管中放入5~6块组织块，再加入权利要求1所 述的冻存液，以20层纱布包裹冻存管，于_80°C -步冷冻24 h后转移至液氮中冻存。
[0009] 本发明的有益效果为:本发明提供的一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛 乳腺组织冻存液及其在在奶牛乳腺组织冻存方法中的应用，能够减少频繁取材的麻烦，降 低取材成本;大大简化组织块剪切、清洗、冻存和复苏等操作过程，有利于保持组织块生物 活性，可有效保存6~8个月。
【附图说明】
[0010] 图1为冻存乳腺组织与新鲜乳腺组织的形态学观察比较。
[0011] 其中，A为冻存组织培养第5天爬出的成纤维细胞;B为新鲜组织培养第5天爬出的 成纤维细胞;C为冻存组织培养第5天爬出的鹅卵石样上皮细胞;D为新鲜组织培养第5天爬 出的鹅卵石样上皮细胞。
[0012] 图2为乳腺上皮细胞的角蛋白18的免疫荧光鉴定。
[0013] 其中A为荧光标记的乳腺上皮细胞角蛋白-18;B为细胞核染色结果;C为A与B的合 并图。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1: 1、冻存液的配制方法： 冻存液A: FBS: DMSO: DMEM/F12按体积比为7:2:1的比例配置，并且DMSO、DMEM/F12均经 过0.22 μπι微孔滤膜过滤除菌，现配现用。
[0015] 冻存液B: FBS: DMEM/F12: DMSO: HEPES缓冲液复配丙酮酸钠的贮存液按体积比为 20:12: 5:3比例配置。HEPES缓冲液复配丙酮酸钠的贮存液的配制方法为：准确称取HEPES 0.9532g、丙酮酸钠 O.llOOg，溶解于30mL基础培养基(D-Hank's)中，充分溶解并混合均匀， 定容至50mL，经过0.22微米微孔滤膜过滤后，避光4°C密封保存备用。即最终的HEPES缓冲 液复配丙酮酸钠贮存液中，HEPES的摩尔浓度为0.8 mol/L、丙酮酸钠的摩尔浓度为0.02 mo 1/L。且DMEM/F12、DMS0均经过0.22 μπι微孔滤膜过滤除菌，该冻存液现配现用。
[0016] 2、实验动物： 试验动物为24月龄健康育成荷斯坦奶牛，无泌乳史。
[0017] 3、采集整体乳腺组织： 试验奶牛屠宰后，乳房表面用清水充分冲洗，75%酒精消毒，高压灭菌解剖刀剖离整个 乳房，置于75%酒精处理过的采样箱中，1 h内带回实验室。
[0018] 4、细胞培养用乳腺组织处理： 再用75%酒精消毒组织表面，避开脂肪组织、结缔组织和血管，无菌操作剪取组织内部 的乳腺实质，取中部组织最佳，特征是组织呈黄色，比较质密，有可见细小导管。剪取的乳腺 实质组织于75%酒精浸泡3 min后转移入细胞间。
[0019] 5、奶牛乳腺组织冻存： 用D-Hank's液浸洗组织4次以去除酒精，剔除外部泛白组织，将乳腺实质剪至约4~5 mm3的小块，每5 mL冻存管中放入5~6块组织，分别采用冻存液A和冻存液B两种方法冻存。 20层纱布包裹冻存管，于-80°C -步冷冻24 h后转移至液氮中保存。
[0020] 6、乳腺组织复苏及细胞培养： 8个月后将存有乳腺组织的冻存管在37 °C水浴中快速解冻，D-Hank ' s液充分清洗组织 块后，采用组织块种植法分离培养奶牛乳腺上皮细胞。接种组织块时每30块为一组，每组3 个重复，连续观察10 d，对有细胞爬出的组织块进行计数，并计算其平均值，组织块存活率 如表1所示(单位:块/天），比较A、B冻存液保存的奶牛乳腺组织爬出细胞的活力。结果，采用 冻存液A保存8个月后的组织块存活率为50%，采用冻存液B保存8个月后的组织块存活率为 61.1%，表明冻存液B对乳腺组织块的保存效果较好。形态学观察结果表明，如图1所示，冻存 组织在第4天有细胞爬出，且部分冻存组织块也可直接爬出鹅卵石样奶牛乳腺上皮细胞，且 其与新鲜组织爬出的细胞形态无明显差别。通过荧光免疫法检测，如图2所示，分离培养的 细胞表达细胞角蛋白18,表明获得的细胞为奶牛乳腺上皮细胞。
[0021] 表1
[0022] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液，其特征在于，是由胎 牛血清FBS、DMEM/F12培养基、二甲基亚砜DMSO和HEPES缓冲液复配丙酮酸钠的贮存液按体 积比20:12:5:3的比例配制的。2. 根据权利要求1所述的一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存 液，其特征在于，所述HEPES缓冲液复配丙酮酸钠的贮存液的配制方法为：准确称取HEPES 0.9532g、丙酮酸钠0.1100g，溶解于30mL D-Hank ' s基础培养基中，充分溶解并混合均匀，定 容至50mL，经过0.22微米微孔滤膜过滤后，避光4°C密封保存备用，该贮存液为现配现用。3. 根据权利要求1所述的一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存 液，其特征在于，所述DMEM/F12培养基和二甲基亚砜DMS0均需经过0.22 μπι微孔滤膜过滤除 菌，现配现用。4. 根据权利要求1所述的一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液 在奶牛乳腺组织冻存方法中的应用，其特征在于，是将乳腺中部组织剪成体积为4~5mm 3大 小的组织块，放入5mL冻存管，每支冻存管中放入5~6块组织块，再加入权利要求1所述的冻 存液，以20层纱布包裹冻存管，于-80 °C -步冷冻24 h后转移至液氮中冻存。
【文档编号】A01N1/02GK106035315SQ201610251629
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】李建喜, 王旭荣, 林杰, 王磊, 张景艳, 王学智, 张康, 杨志强
【申请人】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所