专利名称：卵巢组织异体发育的方法
技术领域：
本发明涉及一种卵巢组织异体发育的方法。
背景技术：
卵巢是雌性生殖系统的功能性器官，主要生理作用为产生卵母细胞和分泌雌性激素，这对维持雌性动物生殖能力和正常的生理活动至关重要。在当前国家推行人与自然的和谐发展理念的时刻，卵巢资源的开发和利用对于人与自然的和谐具有重要影响。目前，全世界有1/4的哺乳动物面临着濒临灭绝。因此，卵巢组织资源的开发和利用对于现代畜牧业的遗传育种、新品种培育和濒临灭绝野生动物的保护具有着重要的意义。肾脏是动物机体泌尿系统的重要成员，具有血液供应丰富和代谢旺盛等特点，另外，肾脏在免疫学上属于免疫盲区，免疫排斥最小，非常适合各种异体组织的寄生和发育。卵巢组织作为重要的遗传资源载体借助肾脏生理环境将具有重要的应用价值。小鼠作为一种重要的实验动物已为人类的生命健康和生命科学的发展做出了重要的贡献。小鼠具有生长速度快、繁殖力高、饲养简单和操作成本低等优点，对于大熊猫、华南虎、雪豹等濒临灭绝的野生动物或优秀的家畜个体，如果这些动物的幼子或成体由于疾病或老年衰老等原因出现死亡时，取出刚刚死亡时动物的卵巢，借助肾包膜下移植能够有效实现遗传资源的保护和开发。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种卵巢组织异体发育的方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是卵巢组织异体发育的方法，包括以下步骤
(1)移植卵巢组织的准备
颈椎脱白处死新生小鼠，分离出新生小鼠的卵巢组织，放入预热的含青霉素与链霉素的PBS液中清洗后，临时培养于37°C预热的组织培养液中；所述组织培养液的成分为PBS液+10% FBS+ 100 U/ml 青霉素 + 100 mg/ml 链霉素；
(2)卵巢组织的移植
受体母鼠移植程序为受体小鼠麻醉后，对受体小鼠两侧背部剪毛，酒精背部消毒，置受体小鼠于热台上，使其 背部向上；在小鼠左侧背腹部开口，摘除卵巢，拉出肾脏，将肾脏暴露于体外，在肾脏被膜打开一个开口，揭起肾脏被膜，将卵巢组织块移植入肾被膜下，把肾脏送入腹腔，喷洒青链霉素粉末，缝合伤口 ；右侧腹部开口，摘除另一侧卵巢，喷洒青链霉素粉末，缝合伤口 ；
受体公鼠移植程序为小鼠经麻醉后，酒精消毒，置于热台上，腹部向上，轻压腹部使睾丸下降至阴囊；剪开阴囊，摘除双侧睾丸，喷洒青链霉素粉末后，缝合伤口 ；翻动小鼠使其背部向上，剪去背毛，左侧背腹部开口，拉出肾脏，将肾脏暴露于体外，在肾脏被膜打开一个开口，揭起肾脏被膜，将卵巢组织块植入被膜下，把肾脏送入腹腔，喷洒青链霉素粉末，缝合伤口 ；
(3)卵巢组织的收获
卵巢组织移植后的第28天，颈椎脱白处死受体小鼠，背侧剖开腹腔，取出肾脏，在含青霉素与链霉素的磷酸盐缓冲液中清洗后，于37 °C预热的所述组织培养液中分离出卵巢组织移植物，机械法分离卵母细胞及各级卵泡，经计数后于体外培养；
(4)卵母细胞的成熟
对于收获的卵母细胞，将其在a -MEM培养液中清洗后，置于卵母细胞体外成熟培养液中进行成熟培养16小时，培养条件为37° C、5% C02、100%湿度；所述卵母细胞体外成熟培养液的组成成分为 a -MEM + 10IU/ml PMSG + 10IU/ml hCG+ 10ng/ml EGF + 5% FBS。作为优选，步骤(I)中所述PBS液含有100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml链霉素。作为优选,所述受体小鼠为无特定病原体小鼠。本发明的有益效果是
采用受体小鼠的肾脏作为卵巢组织移植发育的载体，将异体卵巢组织移植在受体小鼠的肾包膜下，使卵巢组织借助肾包膜同肾脏表面紧密结合，该移植方法具有不破坏肾脏组织、对肾脏和受体小鼠损害最小，及操作简单等特点，因此，卵巢组织的异体发育方法对于挖掘遗传资源开展现代畜牧业的遗传育种、新品种培育和濒临灭绝野生动物的保护具有着重要的意义。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图I是本发明卵巢组织异体发育的方法实施例的卵丘细胞扩展的成熟卵母细胞形态。图2是本发明卵巢组织异体发育的方法实施例的排出第一极体的成熟卵母细胞形态。
具体实施方式
I试验材料与方法 I. I试验动物
试验小鼠为SPF级，供体卵巢组织为新生小鼠的卵巢组织，肾包膜移植受体小鼠为7周龄成年小鼠。试验组一为新生小鼠的卵巢组织移植到17只受体母鼠；试验组二为新生小鼠的卵巢组织移植到17只受体公鼠。1.2试验方法
I.2. I移植卵巢组织的准备
颈椎脱臼处死新生小鼠，分离出新生小鼠的卵巢组织，放入预热的含双抗(100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml链霉素)的PBS液中清洗后，临时培养于37°C预热的PBS液+ 10% FBS(fetal bovine serum) + 100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml链霉素的组织培养液中。1.2.2卵巢组织的移植
受体母鼠移植程序为使用浓度为20mg/ml戊巴比妥钠，受体小鼠按每克体重6微升进行腹腔注射，麻醉后对受体小鼠两侧背部剪毛，使用75%酒精进行背部消毒，置受体小鼠于热台上，使其背部向上。在小鼠左侧背腹部开口约5mm，将眼科镊置于酒精灯上方灼烧至红热后迅速摘除卵巢，轻轻拉出肾脏，将肾脏暴露于体外，在肾脏被膜打开一个开口，轻柔揭起肾脏被膜，将卵巢组织块移植入肾被膜下，把肾脏送入腹腔，喷洒双抗粉末，缝合伤口。右侧腹部开口约5mm，用摘除另一侧卵巢，喷洒青链霉素粉末，缝合伤口。受体公鼠移植程序为小鼠经麻醉后，喷洒75%酒精消毒，置于热台上，腹部向上，轻压腹部使睾丸下降至阴囊。剪开阴囊，将眼科镊子置于酒精灯上方灼烧至红热后摘除双侧睾丸，喷洒青链霉素粉末后，缝合伤口。翻动小鼠使其背部向上，剪去背毛，左侧背腹部开口约5mm，轻轻拉出肾脏，将肾脏暴露于体外，在肾脏被膜打开一个开口，轻柔揭起肾脏被膜，将卵巢组织块植入被膜下，把肾脏送入腹腔，喷洒青链霉素粉末，缝合伤口。
1.2.3卵巢组织的收获
卵巢组织移植后的第28天，颈椎脱白处死受体小鼠，背侧剖开腹腔，取出肾脏，在含100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml链霉素的PBS液中清洗后，于37°C预热的组织(PBS液+10%FBS+ 100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml链霉素)培养液中分离出卵巢组织移植物，机械法分离卵母细胞及各级卵泡，经计数后于体外培养。1.2.4卵母细胞的成熟
对于收获的卵母细胞，将其在a -MEM培养液中清洗后，置于成熟液中进行成熟培养，卵母细胞体外成熟培养液的组成成分为a-MEM + 10IU/ml PMSG + 10IU/ml hCG+ IOng/ml EGF + 5% FBS，培养条件为37° C、5% C02、100%湿度，卵母细胞在成熟培养液中成熟培养16小时。2试验结果
卵巢组织移植的受体小鼠在移植后生长发育良好，精神状态正常。卵巢组织移植到受体小鼠肾包膜下之后经过4周的生长发育，卵巢组织移植物突出于肾脏表面，移植的卵巢组织生长发育良好，主要表现为移植的卵巢组织表面可见清晰的血管和较多的血管分布，血液循环系统在卵巢组织移植物中已得到恢复和发生重建，移植物同肾脏组织结构紧密结合形成组织结合体，两种组织结合部位连接良好，无明显的组织间连接间隙，卵巢组织移植物与肾包膜之间紧密连接。移植的卵巢组织比移植前有明显的生长，体积明显增大。对于雌性和雄性受体小鼠，30个卵巢组织异体异位移植到受体公母小鼠肾包膜下以后，其中，在雌性小鼠受体中16个卵巢组织发育良好，卵巢组织发育成功率为53%(16/30)，在雄性小鼠受体中14个卵巢组织发育良好，卵巢组织发育成功率为47%(14/30);卵巢组织移植物直径超过2mm在雌性和雄性受体小鼠均为10个。卵巢组织移植物在异体小鼠肾包膜下经过4周生长发育后，剥离卵巢组织，从卵巢组织移植物中能够分离到较多由卵丘细胞和卵母细胞形成的复合物，这些复合物中卵丘细胞大小均匀，形态正常，在卵丘卵母细胞复合物中，卵母细胞的重要组成成分透明带已形成并发育良好，形成的透明带包围在卵母细胞周围，透明带形态正常，结构均匀。分离的卵丘细胞和卵母细胞形成的复合物经过体外成熟培养后，卵母细胞周围的细胞形成卵丘细胞扩展，成熟的卵母细胞大小体积正常，并能够排出成熟卵母细胞所特有的第一极体(图I、图2)。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
权利要求
1.卵巢组织异体发育的方法，其特征在于包括以下步骤(1)移植卵巢组织的准备颈椎脱白处死新生小鼠，分离出新生小鼠的卵巢组织，放入预热的含青霉素与链霉素的PBS液中清洗后，临时培养于37 °C预热的组织培养液中；所述组织培养液的成分为PBS液 + 10% FBS+ 100 U/ml 青霉素 + 100 mg/ml 链霉素；(2)卵巢组织的移植受体母鼠移植程序为受体小鼠麻醉后，对受体小鼠两侧背部剪毛，酒精背部消毒，置受体小鼠于热台上，使其背部向上；在小鼠左侧背腹部开口，摘除卵巢，拉出肾脏，将肾脏暴露于体外，在肾脏被膜打开一个开口，揭起肾脏被膜，将卵巢组织块移植入肾被膜下，把肾脏送入腹腔，喷洒青链霉素粉末，缝合伤口 ；右侧腹部开口，摘除另一侧卵巢，喷洒青链霉素粉末，缝合伤口 ；受体公鼠移植程序为小鼠经麻醉后，酒精消毒，置于热台上，腹部向上，轻压腹部使睾丸下降至阴囊；剪开阴囊，摘除双侧睾丸，喷洒青链霉素粉末后，缝合伤口 ；翻动小鼠使其背部向上，剪去背毛，左侧背腹部开口，拉出肾脏，将肾脏暴露于体外，在肾脏被膜打开一个开口，揭起肾脏被膜，将卵巢组织块植入被膜下，把肾脏送入腹腔，喷洒青链霉素粉末，缝合伤口 ；(3)卵巢组织的收获卵巢组织移植后的第28天，颈椎脱白处死受体小鼠，背侧剖开腹腔，取出肾脏，在含青霉素与链霉素的磷酸盐缓冲液中清洗后，于37 °C预热的所述组织培养液中分离出卵巢组织移植物，机械法分离卵母细胞及各级卵泡，经计数后于体外培养；(4)卵母细胞的成熟对于收获的卵母细胞，将其在a -MEM培养液中清洗后，置于卵母细胞体外成熟培养液中进行成熟培养16小时，培养条件为37° C、5% C02、100%湿度；所述卵母细胞体外成熟培养液的组成成分为 a -MEM + 10IU/ml PMSG + 10IU/ml hCG+ 10ng/ml EGF + 5% FBS。
2.根据权利要求I所述的卵巢组织异体发育的方法，其特征在于步骤(I)中所述含青霉素与链霉素的PBS液含有100 U/ml青霉素+ 100 mg/ml链霉素。
3.根据权利要求I所述的卵巢组织异体发育的方法，其特征在于所述受体小鼠为无特定病原体小鼠。
全文摘要
本发明公开了卵巢组织异体发育的方法，包括以下步骤(1)移植卵巢组织的准备；(2)卵巢组织的移植；(3)卵巢组织的收获；(4)卵母细胞的成熟。本发明采用受体小鼠的肾脏作为卵巢组织移植发育的载体，将异体卵巢组织移植在受体小鼠的肾包膜下，使卵巢组织借助肾包膜同肾脏表面紧密结合，该移植方法具有不破坏肾脏组织、对肾脏和受体小鼠损害最小及操作简单等特点，因此，该方法可作为物种卵母细胞资源的储备，对于挖掘遗传资源开展现代畜牧业的遗传育种、新品种培育和濒临灭绝野生动物的保护等均具有着重要的意义。
文档编号C12N5/071GK102703376SQ20121019466
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者刘亚, 张运海, 方富贵, 曹鸿国, 李运生, 杨盼, 章孝荣, 蒲勇, 陶勇 申请人:安徽农业大学