专利名称：辣根过氧化物酶标记核酸探针杂交的标本前处理液及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辣根过氧化物酶标记核酸探针杂交的标本前处理液及其应用。
目前，全球结核病的流行呈现大回升的趋势，在我国结核病仍然是传染病第一号杀手。在结核病实验室传统检测方法中，抗酸染色镜检阳性率仅为30％左右；结核菌素皮试阳性率75％，但假阳性问题严重；培养结果虽然可靠，但结核杆菌生长极其缓慢，需培养3-8周。
显然，传统上用培养方法检测和鉴定致病细菌，是一项耗时的工作，近年来以PCR或核酸探针杂交为代表的基因检测技术开始应用。
前者是最敏感的分子生物学检测方法，但其假阳性和假阴性问题限制了它的应用。而核酸探针非常特异，但其敏感性不理想，难以用于临床标本的检测。对于杂交方法，标本的前处理(酸抽提)方法对结果的影响较大。杂交方法检测的对象是标本中的核酸，后者可以从血液，唾液，痰，尿，粪便，鼻咽分泌物及其它来源的临床标本中制备。传统的核酸提取方法系以有机溶剂(酚和氯仿)对核酸和蛋白质的不同变性作用为基础，其步骤烦琐，核酸的损失率高，用于基因诊断尤其是核酸探针杂交时，对临床标本的检出率不高。故建立一种兼备高敏感性和高特异性的核酸探针检测方法已成当务之急。
本发明的目的是提供一种辣根过氧化物酶标记核酸探针杂交的标本前处理液，及利用它处理标本，并杂交检测基因，该方法在保持核酸探针高特异性的前提下，大幅度提高现有核酸探针杂交技术的敏感性，而且快速，简便。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案这种辣根过氧化物酶标记核酸探针杂的交标本前处理液，它包括初处理液和裂解液，所述的初处理液为NaOH溶液，其浓度为2-6mol/L，所述的裂解液包括NP40(即Nonidet P40)，Tris-HCl，NaCl，MgCl2，该裂解液中各组成部分的浓度是NP40 0.1-2.0％，Tris-HCl 2-20mmol/L、PH＝7.0-8.0，NaCl 5.0-200mmol/L，MgCl20.5-4.0mmol/L。
一种利用权利要求1所述标本前处理液检测标本基因的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)以初处理液、裂解液处理标本，初处理液为NaOH溶液，浓度为2-6 mol/L，裂解液为NP40，Tris-HCl，NaCl，MgCl2，该裂解液中各组成部分的浓度是NP40 0.1-2.0％，Tris-HCl 2-20 mmol/L pH＝7.0-8.0，NaCl50-200mmol/L，MgCl20.5-4.0mmol/L，(2)DNA探针的合成，(3)探针标记辣根过氧化物酶，(4)核酸探针点杂交反应，(a)将前处理的标本固定在硝酸纤维素膜上，(b)预杂交、杂交，(c)杂交膜洗涤，(5)杂交后信号的检测，利用辣根过氧化物酶催化的反应。
标本前处理液使用方法包括下面5个步骤1、取标本，加1至2倍体积的初处理液，置室温液化20-40分钟；2、把标本置于70-90℃的水浴中孵育1小时；3、把标本以12000rpm离心15分钟，弃上清；4、把离心沉淀物与100μl裂解液混合，置于60℃水浴中孵育1小时，然后置于90-96℃水浴中孵育15分钟；5、以8000rpm离心5分钟，取上清液备用。
要求核酸探针的碱基序列对于待检测的对象(致病菌，病毒等)是特异的。核酸探针可以是寡核苷酸探针，或是较长链的核酸探针。核酸探针通过引物合成，PCR技术或分子克隆得到。核酸探针以辣根过氧化物酶直接标记或者间接标记，直接标记是以辣根过氧化物酶直接连接在核酸探针的末端，而间接标记是先把生物素连接在探针的末端，然后再与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素偶联在一起。
本发明采用了一种前处理液，无需PCR，仅以DNA探针直接杂交，继以辣根过氧化物酶催化的反应，有化学发光自显影检测方法，获得了高灵敏度(与PCR相当)和高特异性，而且操作简便，成本低廉，用途广泛。
下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1结核杆菌临床痰标本的收集83例临床标本中，36例结核病人痰涂片阳性标本，32例结核病人痰涂片阴性标本和18例非结核标本来自解放军三零九医院结核科和北京医院呼吸内科。
痰标本的前处理取标本0.1ml，加入0.2ml的初处理液(4mol/1 NaoH)，室温液化30分钟，将标本置于90℃的水浴中孵育小时，将标本以12000rpm离心15分钟，弃上清，将离心沉淀物与100μl裂解液混合，置于60℃水浴中，孵育1小时，然后置于92-96℃水浴中孵育15分钟，以8000rpm离心5分钟，取上清液备用(裂解液组分为NP40 (重量百分)0.5％，Tris-HCl 10mmol/LpH7.6，NaCl 150mmol/L.MgCl21.0 mmol/L)。
核酸探针点杂交反应杂交所用的结核杆菌核酸探针探针特征生物素标记188bpDNA探针的基因序列位于结核杆菌的多拷贝的IS6110插入序列，为结核杆菌所特有。本探针通过PCR扩增反应合成，扩增的引物序列分别为15’-GAACGGCTGATGACCAAACT-3’，引物序列25’-ACGTAGGCGAACCCTGCCCA-3’。
188bpDNA探针的PCR合成扩增过程中，以长链生物素修饰的dUTP(Bio-15-dUTP)部分代替dTTP掺入到扩增混合物中，得到标记率5％左右的探针。188bp片段位于结核杆菌IS6110序列的317bp靶DNA片段的中间(以下简称188bp探针)。Bio-15-dUTPdTTP(1∶3)混合物代替纯dTTP，以纯化的317bpPCR扩增产物为靶DNA片段进行PCR扩增，扩增程序为94℃，1min；65℃，1min；72℃，40s；28个循环，72℃，最后延伸8min。把PCR产物纯化或不经纯化直接用于核酸杂交反应。
结核杆菌标本的点杂交反应过程结核杆菌标本核酸的斑点印迹用15SSC浸泡硝酸纤维素膜15分钟，晾干，然后以微量取样器取经过标本前处理液处理的标本2μl点到硝酸纤维素膜上，晾干，于2mol/L NaOH溶液中5min变性，15×SSC中置15min中和，85℃烘1hr。这样标本核酸就固定到硝酸纤维素膜上。
结核杆菌标本的预杂交和杂交把固定有标本核酸的硝酸纤维素膜与预杂交液(含有0.08％十二烷基肌氨酸钠，0.016％SDS，4×SSC，5×Denhardt’s，和0.1mg/ml鲑精DNA(用前10min沸水浴变性，然后5min冰水浴处理)一起在68℃水浴中孵育1小时。然后再置于杂交液(含80至160ng/ml浓度188bp核酸探针的预杂交液)中以68℃水浴孵育1小时。
杂交液制备取PCR合成的双链188bp DNA探针，经10min沸水浴，5min冰水浴处理后溶于预杂交液。
杂交膜的洗涤把杂交后的硝酸纤维素膜于2×SSC/0.1％SDS中室温孵育5min，2次；再于0.1×SSC/0.1％SDS中68℃水浴15min，2次；最后于0.01×SSC/0.1％SDS中室温孵育8min，2次。
杂交信号的检测偶联反应(即标记在探针上的生物素与辣根过氧化物酶标记链霉亲和素的结合反应)把洗涤后的杂交膜封闭于含0.6％Tween-20，0.05％TritonX-100和3％BSA的缓冲液1中(0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mol/L NaCl，2mmol/L MgCl2)中，室温孵育1hr；再于含4μg/ml链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP偶合物)0.03％Tween20，0.05％Triton X-100的缓冲液I中，室温孵育1hr；再用含0.03％Tween20，0.05％Triton X-100的缓冲液中室温孵育5min，5次；最后在缓冲液II(即溶液0.1 mol/L Tris-HCl pH9.5 0.5mol/L NaCl，10mmol/L MgCl2，Tween-20)和2×SSC中室温分别温育10min，2次。
以辣根过氧化物酶催化化学发光反应对杂交探针信号的检测在硝酸纤维素膜上与标本核酸杂交后的核酸探针已被连接上了辣根过氧化物酶，只要再加入此酶的底物-如化学发光底物或显色底物即可产生信号。当产生化学发光信号时，可以用化学发光仪或化学发光自显影技术记录信号。
化学发光自显影技术不需要任何仪器，因此简便而易推广。它的步骤如下先将结合有辣根过氧化物酶的硝酸纤维素膜浸于2×SSC中，室温孵育5min，2次；再用滤纸将膜稍吸干后放在保鲜膜上；然后将两种化学发光底物液(增敏化学发光液YH-1000购自北医大人民医院)等体积混合，在暗室内加在硝酸纤维素膜上，反应1min；最后，吸去多余发光液，保鲜膜包好发光硝酸纤维素膜，放入X光片夹中，加X光片，合夹。曝光1hr以上，用D-72显影液显影，定影。
检测结果的敏感性将结核杆菌菌悬液依次作3.0×108，6.0×107，1.2×107，2.4×106，0.5×106，1.0×105，2.0×104，4.0×103个菌/ml稀释，以简易的标本处理方法处理后各取2μl点膜，然后用188bpDNA探针杂交和化学发光自显影检测。结果显示本法能够检测到200个菌。
检测结果的特异性
20种分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所，9所非分枝杆菌来自中科院微生物研究所。分枝杆菌包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、胃分枝杆菌、苏如分枝杆菌、偶然分枝杆菌，付偶然分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、龟分枝杆菌，龟分枝杆菌脓肿种，母牛分枝杆菌，不产色分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、次要分枝杆菌、草分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌。非分枝杆菌包括肺炎杆菌、甲链杆菌、金黄色葡萄球菌假白喉杆菌、克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌，大肠埃希菌和卡他球菌等。将受试分枝杆菌接种于改良罗氏培养基上，37℃，培养2-3周；将非分枝杆菌在血琼脂培养其上，37℃，培养过夜，对20种分枝杆菌和9种非分枝杆菌检测时发现只有结核杆菌呈阳性。
临床结核标本的检测阳性率对83例临床标本以前处理液处理后，各取2μl点膜，然后用188bp DNA探针杂交和化学发光自显影检测。可以看到188bp探针杂交检测图片阳性标本和阴性标本的检测率为100％和65.6％(21/32)，非结核标本的检出率为0％。
权利要求
1.一种辣根过氧化物酶标记核酸探针杂交的标本前处理液，其特征在于它包括初处理液和裂解液，所述的初处理液为NaOH溶液，其浓度为2-6mol/L，所述的裂解液包括NP40，Tris-HCl，NaCl，MgCl2，该裂解液中各组成部分的浓度是NP40 0.1-2.0％，Tris-HCl 2-20mmol/L、PH＝7.0-8.0，NaCl 50-200mmol/L，MgCl20.5-4.0mmol/L。
2.一种利用权利要求1所述标本前处理液检测标本基因的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)以初处理液、裂解液处理标本，初处理液为NaOH溶液，浓度为2-6mol/L，裂解液为NP40，Tris-HCl，NaCl，MgCl2，该裂解液中各组成部分的浓度是NP40 0.1-2.0％，Tris-HCl 2-20 mmol/L pH＝7.0-8.0，NaCl50-200mmol/L，MgCl20.5-4.0mmol/L，(2)DNA探针的合成，(3)探针标记辣根过氧化物酶，(4)核酸探针点杂交反应，(a)将前处理的标本固定在硝酸纤维素膜上，(b)预杂交、杂交，(c)杂交膜洗涤，(5)杂交后信号的检测，利用辣根过氧化物酶催化的反应。
3.根据权利要求2所述的利用标本前处理液检测标本基因的方法，其特征在于所述的杂交后信号的检测系利用辣根过氧化物酶催化化学发光来检测。
4.根据权利要求2，3所述的利用标本前处理液检测标本基因的方法，其特征在于所述的以初处理液，裂解液、处理标本的方法是(1)取标本，加入1-2倍体积的初处理液，置室温液化20-40分钟；(2)将标本置于70-90℃的水浴中孵育1小时；(3)把标本以12000rpm离心15分钟，弃上清；(4)把离心沉淀物与100μl裂解液混合，置于60℃水浴中孵育1小时，然后置于90-96℃水浴中孵育15分钟；(5)以8000rpm离心5分钟，取上清液备用。
5.根据权利要求4所述的利用标本前处理液检测标本基因的方法，其特征在于所述的探针为结核杆菌核酸探针，生物标记的188bpDNA探针的基因序列位于结核杆菌的多拷贝的IS6110插入序列为结核杆菌所特有，扩增引物为5’-GAACGGCTGATGACCAAACT-3’，5’-ACGTAGGCGAACCCTGCCCA-3’。
6.根据权利要求4所述的利用标本前处理液检测标本基因的方法，其特征在于所述的在硝酸纤维素膜上与标本核酸杂交后的核酸探针被连接上了辣根过氧化物酶，将该膜浸于2×SSC中，室温孵育5min，2次；再用滤纸将膜吸干后放在保鲜膜上；然后将两种化学发光底物等体积混合，在暗室内加在硝酸纤维素膜上反应1min，移去多余发光液，用保鲜膜包好发光硝酸纤维素膜，放入X光片夹中，加入X光片，曝光、显影、定影。
全文摘要
一种辣根过氧化物酶标记核酸探针杂交的标本前处理液,它包括初处理液和裂解液,所述的初处理液为NaOH溶液,其浓度为2－6mol/L,所述的裂解液包括NP40,Tris－HCl,NaCl,MgCl
文档编号C12Q1/68GK1344809SQ00129710
公开日2002年4月17日 申请日期2000年9月29日 优先权日2000年9月29日
发明者杨树德, 杨华卫 申请人:卫生部北京医院