专利名称：编码eno基因的新核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明提供了编码eno基因的核苷酸序列，和用棒状细菌发酵生产氨基酸、尤其是L-赖氨酸的方法，其中棒状细菌中eno基因是扩增的。
氨基酸、尤其是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，但特别是用于动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性或重要的调节氨基酸营养缺陷的并产生L-赖氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌的生产氨基酸的菌株的改良，其是通过扩增个体氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的影响来改良生产氨基酸的棒杆菌菌株。相关参考文献有Kinoshita(“谷氨酸细菌”，工业微生物的生物学，Demain和Solomon编辑，Benjamin Cummings，英国伦敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸，6261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技术关键综述15，73-103(1995))和Sahm等(纽约科学协会年报782，25-39(1996))。
本发明人目的在于为改良发酵制备氨基酸、特别是L-赖氨酸而提供新措施。
氨基酸、尤其是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，但特别是用于动物营养。因而感兴趣的是提供新的制备氨基酸，尤其L-赖氨酸的改良方法。
当在下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅仅是碱，还可以是盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包括与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选是能复制的DNA，包括(ⅰ)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于序列(ⅰ)的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于序列(ⅰ)或(ⅱ)的序列杂交的至少一个序列，和任选地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中义突变。
本发明还提供了权利要求4的多核苷酸，包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，权利要求6的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，含有权利要求1的多核苷酸的载体，特别是穿梭载体或质粒载体，以及含有所述载体的作为宿主细胞的棒状细菌。
本发明还提供了多核苷酸，其基本上包括一个多核苷酸序列，其可通过用含有SEQ ID NO1所述多核苷酸的序列或其片段的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库含有具有相应于SEQ ID NO1的多核苷酸序列的完整基因。本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码烯醇化酶的全长cDNA，以及分离与烯醇化酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码烯醇化酶的DNA或基因的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续碱基。具有至少40或50个碱基对的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特别是具有烯醇化酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO2的多肽至少70％、优选至少80％相同、特别是与SEQ ID NO2的多肽至少90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸、尤其L-赖氨酸的方法，其中编码eno基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是超量表达的。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及如果需要组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸，此微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032醋谷棒杆菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539Corynebacterium melassecola ATCC17965黄色短杆菌ATCC 14067乳发酵短杆菌ATCC 13869和扩展短杆菌ATCC 14020和从中获得的生产生产L-赖氨酸的突变体或菌株如谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709黄色短杆菌FERM-P 1708乳发酵短杆菌FERM-P 1712谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464和谷氨酸棒杆菌DSM5715本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码烯醇化酶(EC4．2．1．11)的eno基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的eno基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chemie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的E．coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，842160-2164)，在E．coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报745463-5467，1977)所述。
以此方式可获得编码eno基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO1，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得eno基因产物的氨基酸序列以SEQ IDNO2表示。
通过遗传密码的简并性从SEQ ID NO1产生的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，蛋白质中的保守氨基酸置换，如丙氨酸和甘氨酸的置换，或谷氨酸和天冬氨酸的置换，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质活性的基本改置换，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质活性的基本改变，即是功能中性的。另外已知蛋白质N和／或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169751-757(1987))O’Regan等(基因77237-251．(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3240-247(1994))，Hochuli等(生物／技术61321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分杂交的DNA序列也是本发明的组成部分。最后，用产生自SEQ ID NO1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15bp的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，eno基因超量表达后，棒状细菌以改进的方式生产氨基酸特别是L-赖氨酸。
为获得超量表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-赖氨酸发酵生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的超量表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物／技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物／技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4，601，893，Schwarzer和Puhler(生物／技术9，84-87(1991))，Reinscheid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO 96／15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物学综述60512-538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的eno基因可用质粒超量表达。适当的质粒是那些在棒状细菌中复制的质粒。一些已知质粒载体如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64549-554)，pEKEx1(Eikmanns等，基因10293-98(1991))，或pHS2-1(Sonnen等，基因10769-74(1991))，是基于隐蔽性质粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它质粒载体，如那些基于pCG4(US-A4，489，160)，或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学通信66，119-124(1990))，或pAG1(US-A5，158，891)的载体可以相同方式使用。
另外，除eno基因之外，超量表达特定生物合成途径，糖酵解，回补反应，柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶，对氨基酸尤其是L-赖氨酸的生产是有益的。
因此，例如，当生产L-赖氨酸时，·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0197335)可以同时超量表达，或·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns等，细菌学杂志1746076-6086(1992))可以同时超量表达，或·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns等，细菌学杂志1746076-6086(1992))可以同时超量表达，或·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns等，细菌学杂志1746076-6086(1992))可以同时超量表达，或·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns等，细菌学杂志1746076-6086(1992))可以同时超量表达，或·编码赖氨酸输出的lysE基因(DE-A-19548222)可以同时超量表达。
除了超量表达eno基因之外，消除非所需的副反应对氨基酸特别是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
为生产氨基酸，特别是L-赖氨酸，根据本发明产生的微生物可连续培养或用分批方法(分批培养)，或补料分批(补料法)或重复补料分批方法(重复补料法)分批培养。已知的培养法由Chmiel(Bioprozesstechnik 1．Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick／Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D．C．，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，也可使用促进生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至赖氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-赖氨酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经茚三酮衍生化作用进行，如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述。
本发明方法用于发酵制备氨基酸，尤其是L-赖氨酸。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文库如Tauch等(1995，质粒33168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA并用限制性内切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。购自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学院院报842160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编码27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA连接酶(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用GigapackⅡXL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述GigapackⅡXL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，将细胞悬浮于10mM MgSO4并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克／毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 eno基因的分离和测序用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，其中DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报874645-4649)并在含有50微克／毫升zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报745463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。用购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪在“RotiphoresisNF 丙烯酰胺／双丙烯酰胺”凝胶(291)(产品号A124．1，Roth，Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
得到的原始序列数据然后用Staden软件包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP软件(Staden，1986，核酸研究，14217-231)进行计算机辅助编码区分析。进一步的分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余NCBI数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。对该核苷酸序列的分析显示一1275碱基对的开放读框，其被称为eno基因。eno基因编码425个氨基酸的多肽。
序列表<110>，德古萨-于尔斯股份公司<120> 编码eno基因的新核苷酸序列<130> 990152 BT<140><141><160> 2<170> Patent In Ver．2．1<210> 1<211> 1578<212> DNA<213> 谷氨酸棒杆菌<220><221> CDS<222> (151)．．(1425)<400> 1ggctggggat atgggtagtt ttcgccacta atttcaactg attgcctcat cgaaacaaga 60ttcgtgcaac aattgggtgt agacgtgatt gaagacattt gatcacgtga ataattctag 120ttagctccca agttggcata ggaggccaca gtg gct gaa atc atg cac gta ttc 174Val Ala Glu Ile Met His Val Phe1 5gct cgc gaa att ctc gac tcc cgc ggt aac cca acc gtc gag gca gag 222Ala Arg Glu Ile Leu Asp Ser Arg Gly Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu10 15 20gtt ttc ctg gat gac ggt tcc cac ggt gtc gca ggt gtt cca tcc ggc 270Val Phe Leu Asp Asp Gly Ser His Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Gly25 30 35 40gca tcc acc ggc gtc cac gag gct cat gag ctg cgt gac ggt ggc gat 318Ala Ser Thr Gly Val His Glu Ala His Glu Leu Arg Asp Gly Gly Asp45 50 555 cgc tac ctg ggc aag ggc gtt ttg aag gca gtt gaa aac gtc aac gaa 366Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu Lys Ala Val Glu Asn Val Asn Glu60 65 70gaa atc ggc gac gag ctc gct ggc 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1.来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包括与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选地为重组的DNA。
3.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4.权利要求2的多核苷酸，包括如SEQ ID NO1所示的核酸序列。
5.权利要求2的能复制的DNA，包括(ⅰ)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于的序列(ⅰ)的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于序列(ⅰ)或(ⅱ)的序列杂交的至少一个序列，和任选地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中义突变。
6.权利要求2的多核苷酸序列，其编码含包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
7.发酵制备L-氨基酸尤其是L-赖氨酸的方法，其中进行以下步骤(a)发酵生产L-赖氨酸的棒状细菌，该细菌中至少eno基因或编码该基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是超量表达的，(b)富集培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及(c)分离L-氨基酸。
8.权利要求7的方法，其中所用细菌中所需的L-氨基酸生物合成途径的其它基因被额外扩增。
9.权利要求7的方法，其中所用细菌中，降低L-赖氨酸生成的代谢途径至少被部分消除。
10.权利要求7的方法，其中使用经质粒载体转化的菌株，且此质粒载体携带编码eno基因的核苷酸序列。
11.权利要求7-10任一项的方法，其中使用产生L-赖氨酸的棒状细菌。
12.权利要求8的方法，其中编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因同时超量表达。
13.权利要求8的方法，其中赋予S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸抗性的DNA片段同时扩增。
14.权利要求8的方法，其中编码甘油醛-3-磷酸的gap基因同时超量表达。
15.权利要求8的方法，其中编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因同时超量表达。
16.权利要求8的方法，其中编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因同时超量表达。
17.权利要求8的方法，其中编码丙酮酸羧化酶的pyc基因同时超量表达。
全文摘要
本发明涉及分离的多核苷酸,其包括选自如下一组的多核苷酸序列:a)与编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)编码含括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸,以及d)包括a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。本发明还涉及用eno基因的扩增而发酵制备L－氨基酸的方法。
文档编号C12R1/15GK1290750SQ0012957
公开日2001年4月11日 申请日期2000年9月27日 优先权日1999年10月5日
发明者贝蒂娜·默克尔, 瓦尔特·普费弗勒, 托马斯·赫尔曼, 阿尔弗雷德·普尔勒, 约恩·卡利诺夫斯基, 布里吉特·巴特 申请人:德古萨－于尔斯股份公司