专利名称：一种核酸碱基成分的推测方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸碱基成分的推测方法。
分子遗传诊断的基本方法是测定核酸序列的碱基组成或变化。核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核酸的基本单位是核苷酸，它们通过磷脂键连成链状结构，核苷酸的特征决定于其碱基，DNA中的四种碱基由A、C、G、T表示，RNA中的四种碱基为A、C、G、U。核酸中的碱基A与T(或U)配对(互补)，G与C配对(互补)，因为它们之间能形成稳定的氢键结构。有连续配对碱基的两条核酸链能结合(杂交)成双链结构，双链核酸结构在高温(90℃-100℃)下会分裂(变性)成单链核酸分子。核酸中的自然产碱基或核苷酸可被非自然产的类碱基或类核苷酸取代，类核苷酸包括双脱氧核苷酸(ddNTP)、双环核苷酸(LNA)、生物素标记脱氧核苷酸(Biotin-dNTP)和荧光素标记的双脱氧核苷酸(F-ddNTP)。含有由非典型磷酯键组成的核酸包括肽键核酸(PNA)和硫代磷脂键脱氧核糖核酸(S-DNA)。包括类碱基或类核苷酸的核酸可具有荧光性、高稳定性、抗酶降解性等。利用双脱氧核苷酸的特性可测定核酸的碱基序列，因而可以用于分子遗传诊断，但这种传统的序列测定采用电泳的方法，效率较低。一种较简单的碱基测定法是单碱基延伸法(SBE)，这种方法使核酸引物与被检核酸样品(靶核酸)在设定的部位进行杂交，然后在聚合酶的作用下延伸一个双脱氧核苷酸，根据所延伸的核苷酸的碱基成分，推测(求得)靶核酸中被测的碱基成分。这一反应所用的酶只有聚合酶活性，当聚合酶反应出错时，被错加的核苷酸不能被修正，因而会出现假阳性反应，这会降低分子遗传诊断的准确性。在自然界中，许多核酸聚合酶除了具有聚合酶的活性外，还具有外切酶的活性。在这二种酶活性的同时作用下，在核酸复制过程中，一个核苷酸可被置换成另一可识别的具标记的类核苷酸。但这种置换反应所发生的位点较难预测，因而不被用于碱基序列测定。
本发明的目的是提供一种核酸碱基成分的推测方法，可用于分子遗传诊断、核酸多态性测定等，它能克服现有方法的上述不足。
一种核酸碱基成分的推测方法，包括使核酸引物与样品核酸杂交，通过酶反应，推测在样品核酸链上与引物末端碱基位置相应的碱基成分，其特征是引物含有抗外切酶的类核苷酸。
本发明的优点是利用两种酶活性在引物3’末端置换与靶核酸碱基相互补的标记碱基，使碱基的检测准确性得到很大的提高。
下面通过实施例说明本发明。
对病人进行地中海贫血症基因型测定，首先用化学方法合成含抗外切酶的PNA寡聚脱氧核糖核酸，并用其作引物，此引物的碱基序列与待测DNA中突变点后(5’→3’)20个碱基互补，把此引物通过5’端固定于多个小容器壁上，把多个待检测病人的DNA加热变性后分别加入这些小容器中，使其与引物杂交同时分别向各容器内加入缓冲液，并加入由不同荧光色素标记的双脱氧核苷酸，以及具3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。把反应容器置于37℃温度中，使引物3’端进行核苷酸置换反应30分钟后对容器中的样品进行清洗，然后对反应容器进行荧光信号检测，最后根据荧光信号的特征确定标记碱基的存在，用碱基配对原理确定核酸样品(靶核酸)中突变点的碱基成分。
本方法所用的核酸引物含非自然产的类核苷酸或核苷酸替代物，如肽键核酸(PNA)或硫代磷脂键脱氧核糖核酸。测定不同突变点的核酸探针可固定于一个平面上。
本方法所用的核酸样品从生物体中提取或由生物化学或化学合成，包括DNA和RNA，被测的靶核酸具有单链结构或经热变性分裂成单链结构。
本方法所用的酶反应为外切酶反应和聚合酶反应，反应时二种酶活性处于同一反应器中，由一个或多个酶提供。
权利要求
1.一种核酸碱基成分的推测方法，包括使核酸引物与样品核酸杂交，通过酶反应，推测在样品核酸链上与引物末端碱基位置相应的碱基成分，其特征是引物含有抗外切酶的类核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的酶反应为外切酶反应和聚合酶反应，反应时二种酶活性处于同一反应器中，由一个或多个酶提供。
3 如权利要求1所述的方法，其特征是所述的核酸引物含非自然产的类核苷酸或核苷酸替代物，包括肽键核酸和硫代磷脂核酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的核酸样品从生物体中提取或由生物化学或化学合成，被测的靶核酸具有单链结构或经热变性分裂成单链结构。
全文摘要
一种核酸碱基成分的推测方法,包括使核酸引物与样品核酸杂交,通过酶反应,推测在样品核酸链上与引物末端碱基位置相应的碱基成分,其特征是引物含有抗外切酶的类核苷酸。本发明的优点是利用两种酶活性在引物3’末端置换与靶核酸碱基相互补的标记碱基,使碱基的检测准确性得到很大的提高。
文档编号C12Q1/68GK1360056SQ00129419
公开日2002年7月24日 申请日期2000年12月20日 优先权日2000年12月20日
发明者吴昌, 吴明 申请人:吴昌, 吴明