分子物质模块转运系统及其产生方法和用途的制作方法

专利名称：分子物质模块转运系统及其产生方法和用途的制作方法
技术领域：
和
背景技术：
医学基因治疗可以对许多严重的疾病产生持久和温和的治疗，按照一般的看法，代表着对传统医学方法如化疗的一种重要替代方法。通常的方法是基于将治疗上有效的物质，大多基于核酸，靶向地插入体细胞中。基因治疗的目的是治疗先天的基因缺陷(经典的基因治疗)、由感染(如EBV感染、HIV感染)获得的疾病的治疗、或肿瘤治疗。在此前提下，治疗严重疾病的不同原理被概括为基因治疗。
经典的基因治疗解决(遗传的)基因缺陷和相关的疾病，他们大多可被归因于由单一的原因所致(通常是蛋白功能障碍)。这些单因性疾病的一些例子是，ADA缺乏、血友病、杜兴肌营养不良和囊性纤维化，它们的基因治疗方法已经从1990年左右开始试验。其目的是在体细胞中特异地插入适合的基因物质后，取代或补充缺失的蛋白。与此相反，感染学基因治疗尝试着通过消除相应的病原进行病毒或细菌感染治疗；被病毒感染的细胞通常应当在新感染病毒成熟之前得到处理或失活。本研究成果的主要靶方向是HIV感染。与此相反，肿瘤疾病的基因治疗试图将毒性物质转运进入新生细胞中，或应用类似的原理(凋亡、免疫刺激)选择性地消除恶性细胞。
基本上，在基因治疗中根据目前技术状态讨论了两个方法学不同的方案(i)用基因物质，通常用细胞类型非特异的反转录病毒，体外转化分离的细胞；然后，转化的细胞再植入供体内。(ii)靶细胞在体内用特异载体感染；在此，特别使用复制缺陷的反转录病毒或腺病毒或腺伴随病毒。但也有使用物理系统的，如凝聚的DNA、病毒样颗粒和其它。
插入的基因物质，主要是DNA，可整合进染色体(持久表达，例如治疗先天的、单因素疾病)或短暂表达；这足以进行例如感染治疗或肿瘤治疗。在这些情况下，还可能插入反义RNA或核酶以代替DNA，或使用治疗药如肽或蛋白。
尽管对于基因治疗开始了成功的试验，但按照目前的技术状态仍已知有一些问题。例如，复制竞争的反转录病毒作为载体可在动物模型中引起严重的疾病(W.F.Anderson，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)4，1-2，1993；Otto，Jones-Trower，Vanin，Stambaugh，Mueller，Andersen & McGarrity，人类基因治疗(Hum，Gene Ther.)5，567-575，1994)。用体内方法经常只有极少的细胞转化效率，而且用反转录病毒作为载体的细胞定向特异性通常是不确定的。按照GMP条件，对生产来说，此系统过于庞大了；在装配包装细胞系的帮助下，病毒载体的产生依次会导致制备方法的过度分析。这些和其它在下面描述的目前技术状态的缺点，按照本发明，将被用新的模块载体系统作为分子物质的转运载体克服。
几乎所有熟知的病毒和噬菌体都有衣壳，至少由一种或数种蛋白构成，病毒基因组封装在其中。衣壳显示限定的形态，对某一病毒或噬菌体是特征性的。特别经常构建的是二十面或丝状衣壳。表1显示了有关熟知病毒形态学的概况。有大量的实施例，即那些衣壳能够在体外没有病毒基因组或细胞因子存在的情况下从分离的病毒蛋白构建而成。由此得到的结构由空的或充满的蛋白外壳组成，被称为病毒样或类病毒颗粒。
表1.熟知病毒和病毒家族的形态学形态学 代表(病毒或噬菌体)无定形或未知 伞状病毒(Umbravirus)；细病毒杆状的 杆状病毒科；Badnavirus；Barnaviridae；线状病毒科；棒状病毒丝状的 毛状病毒组；荷兰石竹潜伏病毒；多形多核病毒；真菌传棒读组；丝状噬菌体科；脂毛病毒；马铃薯X病毒；马铃薯Y病毒组；烟草花叶病毒；托博拉病毒；多DNA病毒螺旋状的 大麦病毒；副粘病毒；Trichovirus二十面的 腺病毒科；星形病毒科；双RNA病毒；溴病毒；杯状病毒科；花椰菜病毒；圆环病毒科；豇豆花叶病毒科；覆盖噬菌体科；香石竹病毒；Enamovirus；嗜肝DNA病毒科；疱疹病毒；Idaeovirus；虹色病毒科；轻小病毒科；黄矮病毒组；Machlomovirus；玉米雷亚多菲纳病毒组；微小噬菌体科；坏死病毒；野田村病毒科分；乳头多瘤空泡病毒；分病毒；细小病毒；藻DNA病毒；细小的核糖核酸病毒；新病毒；Rhizidiovirus；Sequiviridae；南方菜豆花叶病毒；复层病毒科；四病毒科；番茄丛矮病毒科；全病毒科；芜箐病毒立方的 囊状噬菌体科；双生病毒科椭圆的 痘病毒多晶形的 冠状病毒科；Hypoviridae；原生病毒科球形的 沙粒病毒科；Arterivirus；Bunyaviridae；黄病毒科；正粘病毒科；反转录病毒科；囊膜病毒柠檬形的 Fuselloviridae未分类的高耐温 杆菌病毒科；杜仲病毒科噬菌体和病毒类有尾突的噬菌体 肌病毒科；短尾病毒科；长尾病毒科类当用这种病毒样颗粒作为转运载体时，所用的外壳蛋白必须在适合的表达系统中生产。特别是使用真核系统例如杆状病毒感染的昆虫细胞；或原核系统例如重组体大肠杆菌。对于真核表达系统，完整的病毒样颗粒在细胞内构建；而且，这样有可能产生从不同病毒蛋白构建的病毒包被，例如多瘤病毒外壳蛋白VP1和VP2(An，Gillock，Sweat，Reeves & Consigli，遗传学病毒杂志(J.Gen.Virol.)80，1009-1016，1999)。这些方法的缺点是产生上述所有的病毒衣壳很浪费，花销昂贵。病毒外壳蛋白在大肠杆菌内表达过程中，完整的病毒衣壳不在细胞内构建而是产生壳粒，后者必须从细胞中分离，并在体外组合成病毒样颗粒。然而，必须找到获得大量的外壳蛋白的可能性，即适合的体外装配相应的外壳蛋白的方法。进而，用本方法可能构建不同病毒外壳蛋白的病毒衣壳，它们是在相应的病毒中自然发生的，例如单纯疱疹病毒衣壳可以由VP5、VP19C和VP23组成(Newcomb，Homa，Thomsen，Trus，Cheng，Steven，Booy & Brown，病毒学杂志(J.Virol.)73，4239-4250，1999)。但是用不同的、修饰的部分单位构建病毒衣壳的可能性在目前技术中没有描述。
在体外适合的溶剂条件下，多瘤病毒的VP1蛋白自动组合成病毒样外壳；野生型蛋白的这种特性已经是现有技术。此过程可被用于产生分子转运载体以定向传递分子(例如治疗药物)，后者被封装在病毒样颗粒的外壳中。除重要结构的研究发现外，关于多瘤病毒VP1蛋白的分子生物学和病理学特性也被极好地确定。公布的研究包括产生、纯化和定性，以及蛋白的构成和装配(Rayment，Baker & Caspar，自然295，110-115，1982；Garcea & Benjamin，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)80，3613-3617，1983；Slilaty &Aposhian，科学220，725-727，1983；Leavitt，Roberts & Garcea，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)260，12803-12809，1985；Moreland，Montross & Garcea，病毒学杂志(J.Virol.)65，1168-1176，1991；Griffith，Griffith，Rayment，Murakami & Casper，自然355，652-654，1992)。特别地，根据现有技术，详细记录了在体外的装配(Slilaty，Berns & Aposhian，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)257，6571-6575，1982；Salunke，Caspar & Garcea，Cell 604，895-904，1986；Garcea，Salunke & Caspar，自然329，86-87，1987；Salunke，Caspar & Garcea，生物物理学杂志(Biophys.J.)56，887-900，1989)。用本法构建的载体含有天然存在蛋白的亚单位，其可能的用途通常被描述为基因转染(Forstová，Krauzewicz，Sandig，Elliott，Palková，Strauss，&Griffin，人类基因治疗(Hum.Gene Therapy)6，297-306，1995)。在WO 97/43431中描述了一个转运分子物质的载体，含有至少一个来自病毒的壳粒，并在其一侧显现修饰，以使分子物质能够结合到壳粒上。
至今，对于嵌合样方式的多瘤病毒衣壳，或由各种修饰的部分单位或相似的多修饰部分单位组成的其它类病毒颗粒，的体外装配方法还没有作为现有技术被描述，因为部分单位的修饰经常导致部分单位组合能力的丧失。
因此，本发明的任务是提供一个分子物质的模块转运系统，它由不同修饰的部分单位或相似的多修饰部分单位组成，且没有现有技术的缺点。
为完成这个任务，本发明提供了根据权利要求1所述的分子物质转运系统，在氨基酸基础含有重组产生的部分单位组成，包括—至少两个两者的修饰不相同的部分单位，和/或—一个或数个有两次不同修饰的部分单位，和—可选择地未修饰的部分单位，其中的部分单位能够形成一个类嵌合体的转运系统，另外分子物质可被封装进转运系统中。
转运系统的优选形式及其产生和使用方法见下面的从属和说明书得出的。

发明内容
应用天然病毒或病毒类似物系统将核酸转染进细胞(基因治疗)，是分子药物领域中重要的研究内容。对此，根据现有技术，一个特殊的挑战是产生一个排除或最小化涉及基因治疗缺点的载体系统(转运系统)。
在本发明中，描述了一个分子物质的转运系统，它可以在体外由不同的单个成分装配而成。这是通过使用分子成分或部分单位(模块)而实现的，它包括本发明的蛋白。根据本发明，这些部分单位可以用不同的方式被修饰，即部分单位的氨基酸序列可以被改变、延长或缩短，以将所需的这些模块的特性整合进转运系统。特别地，通过融合和插入，此单位也可以含有来自其它蛋白的功能基团。单个的功能单位可在体外被组成(装配)，或者由于其分子特性直接进行，或者例如在单位没有组合能力时，通过耦合到具有所需的组合能力的特殊单位上而完成。在本发明的范畴内，由于其组成而具有某种功能的病毒样颗粒可以以嵌合方式构建。一个特别的优点是转运系统的分子组成可通过化学计算确定。新出现的病毒样颗粒可被用来有效地转运分子物质如核酸、肽或蛋白，并靶向导入真核细胞内部。本发明的一个执行示意图见


图1。
对于本发明，转运系统可以包括修饰的病毒或噬菌体的部分单位，见表1，或巨分子蛋白组合物的部分单位，后者具有类蛋白酶体或陪伴分子的内部空腔，以及可选择地包括其未修饰的部分单位。根据本发明，转运系统可以包括部分单位的单体、二聚体或低聚体。本发明优选转运系统的部分单位来自多瘤病毒VP1蛋白或其修饰的部分单位。进一步，优选转运系统的部分单位来自噬菌体蛋白，特别是那些显示嗜热生物宿主或超嗜热菌来源的噬菌体，因而在高环境温度(≥70℃)下仍能形成稳定的结构。这里需要强调SSV1颗粒(Fuseolloviridae)，它感染古细菌shibatae硫叶菌。因其宿主特异性，该噬菌体代表为超嗜热菌，因此在高温度下也是稳定的，并适于在生物技术和药学领域中大量应用。它可以形成非常稳定的蛋白外壳，并易于重组产生构建模块。还可以发现类似的嗜热或超嗜热噬菌体代表，如脂毛病毒科(代表TTV1，TTV2，TTV3)。也可以用于此过程的Bacilloviridae(例如TTV4，SIRV)和Guttaviridae(例如SNDV)嗜热或超嗜热代表还没有进一步分类，其中在其它因素中，蛋白外壳(来自噬菌体蛋白)的稳定性是相关的。
本发明进一步重组地产生了修饰的部分单位。
按照本发明，转运系统包括至少两个两者的修饰不相同的部分单位，其中“不同修饰”是指部分单位表现不同的修饰，或在部分单位的不同位置表现相同的修饰。
本发明的转运系统也可以包括一个或数个至少修饰两次的部分单位，且优选两次修饰不显相同的部分单位。
另外，本发明的转运系统可以包括未修饰的部分单位。
根据本发明，可以通过在部分单位的末端和/或目的区域和/或在序列中的点突变或插入、移除或改变一个或数个氨基酸、肽或蛋白序列或蛋白结构域修饰重组产生的部分单位。
例如，修饰可以被标记，如用荧光染料、聚乙二醇、寡核苷酸、核酸、肽、肽类激素、脂类、脂肪酸或糖类。
部分单位的修饰也可以引起部分单位与分子物质结合亲和性的改善，例如富含脯氨酸序列、WW序列、SH3结构域、生物素、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、或多离子序列。这些修饰优选位于转运系统内部。
进一步，可以根据本发明设计修饰，通过这些修饰改善所需靶细胞的摄取，例如通过碳水化合物结构、蛋白或蛋白结构域、抗体或修饰的抗体、抗原、或分离的配体受体结合区、或可以介导与靶细胞表面受体结合的其它物质或序列。
此外，根据本发明部分单位可以出现修饰，通过这些修饰有可能实现向靶细胞特定细胞器的转运(例如核、线粒体、内质网)或转运出靶细胞。这个改善摄取入靶细胞、细胞器或转运出靶细胞的修饰大多在转运系统外部，或者是被转运分子物质的一个成分。
根据本发明，产生转运系统的过程包括以下步骤—部分单位的重组体表达，—通过溶解宿主细胞释放部分单位，—按所需的化学数量关系建立部分单位的接触，以组成(装配)类嵌合样的转运系统，和—在装配前或其间与分子物质进行接触，以将分子物质封装进转运系统内。
本发明描述的起始点是目前通常的实验性基因治疗方法的有利替代，如应用病毒、脂质体或物理系统。例如，当使用复制缺陷病毒时，必须进行广泛的检查以保证这些载体的生物学和治疗安全性。与这些系统相反，本发明描述了一个简单的、逐步在体外构建病毒样颗粒为主体的方法，它包括在嵌合体中组成的部分，因此对于药物或治疗应用是非常安全的。
与传统的、大多数的反转录系统相比较，本发明中描述的组合构建人工病毒载体系统的优势概括如下●避免了在构建人工的复制缺陷病毒(反转录病毒、腺病毒)中经常讨论的载体安全问题，因为这里不复杂的、可能致病的病毒通过某些方式被减弱，而只是与所需的特性人工相连，如由蛋白构建。衣壳的完全体外合成使基因治疗应用对安全系统的最大要求得以实现。单一成分完全与治疗起始点分离；治疗上有效的物质(DNA、RNA、或类似的分子)不包括任何形成分子载体的信息。因此，复制竞争种属的出现可以完全排除。此外，最终的载体不包括颗粒构建计划的任何基因信息，因此不利的重组事件的潜在危险完全不存在。
●成分的体外装配保证了系统的高纯度和同质性，根据现有技术，各成分可以高质量地分别生成。通过对分离成分的高度特异的亲和纯化步骤(此时，例如，这是由自体剪接蛋白在亲和基质上完成的)，所有不需要的、有问题的成分(污染的DNA，细菌蛋白和内毒素)可以被有效地去除。
●在每个特定变异体亚单位中独特半胱氨酸残基的帮助下，可以荧光标记合成(重组)产生的病毒衣壳，或可提供具有分子标记，适于进行PET(正电子发射断层扫描)和其它定位方法的所述的病毒衣壳。这些标记能够用共聚焦荧光显微镜方法在(未固定的，即活的)细胞内探测载体，以及以时间分辨的方式在整体的活生物体中探测。
●系统所有成分的荧光标记可以通过衣壳的FACS分析控制制备组合物的质量，其中所述的组合物可以通过单一颗粒的统计计数可以精确地测定。
●原则上在体外及体内应用载体是可能的。
与由同质成分(例如文献中描述的病毒样颗粒)组成的系统相比，根据本发明组合地构建人工类病毒的载体系统的优点总结如下●基因治疗方法单独步骤最少需要的分离(不结合的)是可能的(i)疾病特异的治疗药物的特定包装，(ii)细胞特异的靶向(细胞趋向性)，(iii)内涵体的摄取和释放，(iv)细胞内区室特异的转位，和(v)选择性启动治疗物质的作用。
●载体的组合结构得以选择性地将所有必需的功能整合进合成的颗粒中，它只具有对于这种应用所需的的功能进行考虑。例如，转运疾病特异的治疗药物(例如通过组织特异的启动子引起治疗基因的表达的DNA)不必需要细胞类型特异靶向的结构域。
●可准确定量颗粒组合物能够以准确需要的剂量整合各种所需的功能。因此得以减少或避免高治疗剂量下不需要的副作用。
●不同的治疗靶向并不需要设计完全新的系统或治疗方法，而只是插入一个新的构建模块或修饰完整系统的已经存在的成分。在肿瘤治疗范围内，例如，抗肿瘤药物可以转运进肿瘤组织中，该肿瘤组织中特定类型的肿瘤细胞通过相应受体结合区被特异定位。受体结合区的改变可以将同一治疗药物转运进入另一个类型的肿瘤细胞。此外，作用不同的治疗药物可被用于另一个天然系统，例如通过改变治疗药物(例如DNA、RNA、肽或蛋白)特定包装上的某个结构域。
●通过比较性检测不同的功能模块可以容易地确定治疗方案的潜在弱点，随后消除它，并可以获得对天然病毒分子生物学基本过程的较好理解。
可以产生转运系统的单一构建模块(部分单位)，因此它们具有各自的功能特性。嵌合样组成(装配)在体外进行，并通过化学计算的添加构建模块和适合的装配条件而被确定。转运系统的构建模块通常是重组产生的。因此，产生的病毒样外壳结构(衣壳)可以显示相应应用所需的特性和功能。考虑到模块功能和分子特性，单一模块是各自独立地产生的，通过进一步添加模块可以提供和补充新的功能和应用领域。像这样产生的分子物质转运系统特别适合用于基因治疗领域，也适合特异性插入药物，如DNA或蛋白，进入真核细胞。
根据本发明的一个应用形式，多瘤病毒VP1蛋白改变了其天然特性，并提供了一个具有现有技术没有描述过的特性的转运系统。例如不影响装配的情况下，可以改变VP1蛋白，以消除不需要的天然特性，例如与细胞，如鼠肾上皮细胞，表面上的特异性受体结合。另一方面，通过导入特异性新序列，可以调整真核细胞的包涵机制；某些序列基序刺激细胞的摄取。
蛋白的三维结构是熟知的(Stehle，Yan，Benjamin & Harrison，自然369，160-163，1994)。在本发明的范围内，可能显示以结构域形式的功能模块，如受体特异的对接区(细胞类型特异的靶向)，可以被插入蛋白外部的至少两个环形片段(氨基酸位置148和293)(比较实施例4)。
进一步，通过改变亚单位及装配的衣壳的半胱氨酸组成，显示发生二硫桥键形式的调整也是可能的。在此情况下颗粒的生物学稳定性可以被改变。
根据本发明，产生了VP1蛋白的变异体，它具有天然野生型蛋白没有显示的特殊的、新的特性。这里证实，经实施例1所描述的方法产生和纯化修饰的VP1蛋白是特别有利的。此外，通过基因工程的手段(点突变，见实施例2、3和5)可以进行改变，且添加的(功能性)结构域、肽或蛋白可被固定在VP1蛋白的末端或插入VP1蛋白的序列中(比较实施例4)。这些功能单位可以扩展外壳蛋白的特性，例如有关特异性受体对接、有效地摄取进入靶细胞、或结合和包装要转运的分子的功能。特别地，通过以嵌合样方式装配不同的外壳蛋白可以将单一功能的单位结合在一个包装中，这样形成了多功能的病毒样颗粒。这里，在一个病毒衣壳中每个功能单位的合适数量可以根据应用的类型而确定。像那样构建的一个人工的、病毒类似物的颗粒可被用在许多方面，但可特别地用于特异性传递治疗有效的分子物质进入靶细胞。本发明描述了以嵌合样方式构建的、用于治疗物质的模块转运系统，其中依相应的用途可以容易和快速地改变系统。本发明的一个应用领域可以是感染性疾病的治疗，如AIDS。在AIDS，HIV病毒在CD4+淋巴细胞中发生倍增，导致了所描述的症状。在感染的后期，感染的细胞表面呈现病毒蛋白gp120，它与天然受体CD4结合并使病毒摄取进细胞。通过修饰本发明描述的转运系统表面，该机制可被用于细胞特异的靶向，采用与gp120结合必需的受体CD4或单一CD4结构域修饰。由于CD4与gp120的相互作用是高度特异的，且不在身体的任何其它组织发生，因此这种转运载体只与已经被感染HIV的淋巴细胞相互作用，即如所期望的，治疗物质专门转运进感染的细胞。
在细胞内编码活性抗体的DNA可被用作治疗物质，抗体依次与HIV蛋白特异性地结合，因而在功能上中和它们。治疗性DNA可以作为单或双链核酸插入细胞。在插入双链DNA的情况下，通过插入与dsDNA相互作用的单一、修饰的模块可以实现包涵进颗粒。这种模块在颗粒内部可以携带与DNA相互作用的基本序列。此外，偶联DNA嵌入物质以结合双链DNA是可能的。反过来，通过应用有ssDNA结合蛋白的模块，单链DNA也可以直接进入颗粒。序列特异的寡核苷酸偶联到颗粒内部会是有可能的，它通过杂交的方法用治疗性ssDNA组成了一个装配。
另一个用于HIV治疗的出发点可能是包装具有一个HIV-RNA特异识别序列的核酶。病毒RNA被催化分离，并在与核酶结合时失活。在此情况下，包装核酶可以用具有RNA结合区的模块或类似构建块完成，以用寡核苷酸修饰的载体封装ssDNA。插入蛋白或肽作为核酸的代替物也可以进行治疗。插入的转优势(修饰的)蛋白可与天然HIV蛋白在细胞内竞争，从而抑制其功能。而且，肽或人工合成的修饰的肽可以抑制某些HIV蛋白的作用，例如HIV蛋白酶。进一步，通过相应的信号序列有可能引导细胞内的蛋白进入细胞，例如在病毒SV40大T-抗原的核转位序列的帮助下进入核。这对于与位于核内的因子的相互作用是必要的，例如HIV-Tat蛋白，它尤其作为细胞核内的转录因子并明显增加病毒蛋白的转录。通过与含序列特异结合区的模块结合可以将蛋白包含进转运载体，其结合的方式是，结合的蛋白被带进载体内。此外，提到的蛋白或肽可以直接融合到载体构建块上，其融合方式是在胞内释放蛋白或肽和在特异感染的细胞之间有一个HIV蛋白酶或细胞蛋白酶的识别序列。
本发明的另一个应用是对恶性疾病的抗肿瘤药物的应用。因此，载体必须含有保证转运药物进入肿瘤组织的构建块。这一点是根据肿瘤的类型，例如通过位于颗粒表面的抗体实现，抗体与只在肿瘤细胞上专门或最大程度存在的肿瘤抗原结合。实体瘤需要足够的血液供应，因此分泌生长因子启动肿瘤组织内新血管的形成。新形成的血管上皮细胞表达质膜结合的整合素受体的数量增加。这些受体特异地识别RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)，并引起受体介导的含RGD配体的内吞作用。此特性也可被用于定向肿瘤细胞和与之相连的上皮组织，通过将RGD暴露模块整合进转运载体，使得治疗物质包涵进入肿瘤组织。不同受体结合特性的结合除引起组织特异性改善之外的治疗，它还在数个位点进攻肿瘤，同时减少了耐药细胞的形成。
核酸样单-或双链DNA或RNA可被用作药物。它们编码的蛋白可以，例如通过在相应位点干扰细胞信号转导级联而启动细胞内凋亡。为扩大肿瘤特异性及因此提高安全性，启动子可被用于优先在肿瘤细胞内活动的转录。引起基质金属蛋白酶抑制的肽可以同样的方式应用。特别是通过特异性短肽序列抑制MMP-2和MMP-9可在此显示有效的作用。
除了提到的核酸，也可包装蛋白和肽启动凋亡或坏死。适合于此的是，例如，细菌毒素(如白喉毒素、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素，和其它)的催化区，它高效的抑制细胞的蛋白生物合成，因此引起坏死。在此，仅需要极少的分子以杀死细胞是有益处的。另一个治疗的出发点表现为将单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶转运进肿瘤细胞。此酶磷酸化核苷酸构建块，同细胞激酶相比显示较少的底物特异性，因此人工核苷酸如9-[1，3-二羟基-2-丙氧甲基]鸟嘌呤也被磷酸化。磷酸化的9-[1，3-二羟基-2-丙氧甲基]鸟嘌呤在DNA复制过程中被作为新合成的DNA链的组成部分，并引起复制的停止，反过来阻止了细胞分裂。
基本上，这里描述的发明也可以用于校正遗传的基因缺陷，如ADA缺乏、血友病、杜兴肌营养不良和囊性纤维化。这些疾病是单病因的，即它们可以归因于单一基因的缺陷。因此以正确的形式插入该基因通常足以补偿或减少症状。对于此应用，必须获得稳定的基因表达，或者通过稳定的游离基因载体，或者通过整和治疗性DNA进入细胞染色体。因此，传递的核酸可以包括使整合更容易的序列。例如，可以使用在其末端携带有来自腺伴随病毒的ITR序列(反向末端重复)的单链DNA，它对染色体整合有作用。此外，除了治疗性DNA或RNA以外，催化整合活性的蛋白可被转运进细胞，例如HIV整合酶、或来自腺伴随病毒的Rep78和Rep68。
在天然启动子的控制下，校正基因可以理想地表达，通过它同时保证被采用的调节。在许多情况下，转运载体的细胞类型特异的靶向不是必须的。例如，血友病病人能够从肌肉组织中的血液凝固级联中产生缺少的因子，这些因子与适当的信号序列融合，以便从细胞中分泌并到达其作用的部位，血流中。
在所有实际应用中，细胞内治疗物质的有效释放是必须的，即物质必须成功地穿过内质膜。此功能可以用溶血素实现，特别是硫醇活化的溶细胞素、细菌毒素的转位区、或某些病毒蛋白如腺病毒五位体蛋白。这些功能可被包括进转运载体中，该载体作为本发明描述的载体系统的一部分以嵌合方式组成。进一步，该功能可由化学物质如多聚阳离子或dendrimers完成。相应的成分或者必须被带到颗粒的表面或者必须封装在颗粒内。
对于许多应用，还必须尽可能少的保持转运系统以及治疗药物的免疫原性。本发明通过用聚乙二醇掩盖或用脂质双层包封，获得转运系统本身的体液免疫原性及被巨噬细胞识别和清除。聚乙二醇可被化学修饰，使其与颗粒表面上的特异-SH基团共价结合。治疗药物的免疫原性，即直接插入的蛋白或来自治疗性核酸转录的和/或翻译的蛋白，可以通过35与40 GA-(甘氨酸-丙氨酸)重复序列的融合而减少。富GA-序列天然存在于人Epstein-Barr病毒的EBNA1蛋白中，防止病毒蛋白被细胞蛋白酶类降解并呈现在1型MHC受体上。该安全功能，可依次在在不同蛋白和肽上执行，作为嵌合样载体系统的一部分，体外装配在此起正性作用。
实施例下面的实施例显示本发明的应用，但不应当限制发明保护的范围。在说明书的实施例中涉及下面的附图。
图1是本发明可能的装配形式的示意图。一个衣壳由至少修饰两次的同样的亚单位或不同的部分单位(成分)组成，以嵌合样方式构建。装配的衣壳可显示某些被选之前的特性，这使其适合于例如基因传递。
图2显示PyVP1-CallS的生成。(a)按照实施例1指示的条件表达和纯化PyVP1-CallS变异体。(b)凝胶过滤以检测PyVP1-CallS变异体的装配活性。衣壳洗脱在6和8ml间，在9和10ml间不含壳粒。(c)衣壳的电镜图像，专门含有PyVP1-CallS变异体亚单位。刻度杆100nm。
图3显示PyVP1-CallS-T249C的壳粒。(a)PyVP1-CallS-T249C五面体壳粒三维结构示意图的顶视图(部分视野)。每个亚单位的249位氨基酸用一个球标记；在这个被保护的位置，可能有壳粒特异的、中性标记。(b)相对于对照PyVP1-CallS(右半部分)，在独特半胱氨酸处PyVP1-CallS-T249C蛋白(左半部分)的特殊标记。用库马西染料引起的染色(下部分)显示蛋白存在，不仅是在249位有半胱氨酸的变异体可被如得克萨斯红的染料标记(上部分)。(c)凝胶过滤以确证PyVP1-CallS-T249C变异体的装配活性，并结合染料进衣壳。衣壳洗脱在8和10ml间，在11和12ml间不含壳粒。(d)衣壳的电镜图像，专门含有荧光标记的PyVP1-CallS-T249C变异体亚单位。刻度杆100nm。
图4显示对细胞溶解产物的检测。同荧光素标记的PyVP1-CallS-T249C衣壳孵育1小时后，真核C2C12细胞溶解产物的SDS凝胶(未标记的)。摄取进细胞的衣壳很大程度上被蛋白水解降解，荧光染料仍然清楚可见，因此得以检测衣壳摄取进细胞。泳道1，用得克萨斯红标记的VP1-CallS-T249C；泳道2，细胞上的液体(上清)；泳道3具有包含颗粒的细胞溶解物；泳道4PBS的细胞冲洗馏分(不包含衣壳)；泳道5到10每个泳道类似于泳道2到4的同样平行试验。
图5示意装配。(a)用凝胶过滤方法对PyVP1-2C变异体装配的分析。和PyVP1-CallS变异体的装配(图2b)形成对比，壳粒完全地装配成衣壳(在6到8ml洗脱)，不再检测到游离的五面体(9到10ml)。(b)完全由PyVP1-2C组成的衣壳的电镜图像。
图6显示衣壳的合并。(a)没有RGD序列基序，(b)有RGD序列继基序，在Caco-2型真核细胞内，其它条件相同。(a)PyVP1-CallS-T249C型衣壳被得克萨斯红标记，在荧光显微镜下可见到衣壳被摄取进细胞。(b)衣壳在同(a)一样的条件下被摄取，但荧光标记的衣壳是PyVP1-RGD148型。由于RGD基序，这些衣壳更显著有效地被摄取进细胞。
图7显示不同标记的PyVP1变异体的FACS分析。从PyVP1-CallS-T249C形成的衣壳，包括一种用荧光素标记种类，其它用得克萨斯红标记。衣壳群显示明显的荧光素荧光(a中的M1)以及得克萨斯红荧光(b中的M2)。通过应用荧光素(FL1)与得克萨斯红(FL3)荧光的对比，很明显两种染料均位于一个颗粒上(c中的右上象限)，仅含一种染料的颗粒不产生，因此未检测到。
图8显示装配的分析。(a)装配缺乏成分PyVP1-Def的凝胶过滤分析。在标准的装配条件下没有衣壳形成，只检测到壳粒(在9到10ml下洗脱)。(b)混合装配衣壳的凝胶过滤分析，由PyVP1-Def(荧光标记的)和PyVP1-CallS组成(化学计量比1∶5)。(c)在壳粒不同化学计量定量比例下，衣壳中包含PyVP1-Def的比例。
图9显示了无半胱氨酸PyVP1-CallS-WW150和含半胱氨酸PyVP1-wt的混合装配。(a)凝胶过滤分析显示PyVP1-CallS-WW150变异体仅被装配大约15％。衣壳洗脱在6和8ml间，在11和12ml间不含壳粒。(b)PyVP1-wt变异体的壳粒定量地形成衣壳。(c)当两种变异体克分子数相等的混合装配时，形成定量混合的衣壳，不再检测到游离壳粒。于是，PyVP1-wt定量装配的特性完全传递到混合组成的(嵌合样)病毒衣壳。
图10显示细胞摄取。装配的PyVP1-CallS-T249C的衣壳掺入C2C12细胞并可用CLSM方法看到。除衣壳染色(红色，得克萨斯红染料，分子探针)外，还显示了晚期包涵体(绿色，荧光素-右旋糖苷染料，70kDa，分子探针)、核(绿色，SYTO-16染料，分子探针)和溶酶体(蓝色，Lysosensor Blue-Yellow染料，分子探针)。(a)到(c)，摄取15分钟后衣壳的定位；(d)到(f)，摄取60分钟后衣壳的定位。衣壳通过细胞内吞作用包含进细胞，经过早和晚期(15分钟)包涵体，最终在溶酶体中富集(60分钟)。
图11显示李斯特赖氨酸O蛋白。(a)来自产单核细胞李斯特菌的李斯特赖氨酸O蛋白(LLO)的纯化。泳道1，分子量标准(10kDa阶梯)；泳道2，纯化的LLO融合蛋白和按照实施例8的纤维素结合结构域；泳道3，用肠激酶裂解融合蛋白并释放LLO。(b)LLO蛋白的活性，在添加LLO并将pH值降低到pH6.0以下后，通过荧光染料(钙黄绿素，Sigma)从含胆固醇的脂质体中释放的时间过程显示。在对照实验中，BSA以及LLO在pH7.0使用；这些不诱导荧光染料的释放。
实施例1无半胱氨酸外壳白PyVP1(PyVP1-CallS变异体)的产生、装配和特性在所给实施例中使用的病毒外壳蛋白来自溶液中的多瘤病毒VP1五面体蛋白，它可以按照现有技术容易地在体外装配成包膜。在该实施例中，产生了多瘤病毒变异体，在序列中不显示任何半胱氨酸；野生型蛋白的6个半胱氨酸(Cys-12、Cys-16、Cys-20、Cys-115、Cys-274和Cys-283)按照现有技术通过位点定向的突变过程被丝氨酸替换。这对于蛋白状态不受溶液的氧化还原条件影响是格外有利的；因此，此蛋白在大量应用中通常较易控制。
根据制造商说明，突变过程在Quickchange方法(Stratagene)帮助下进行。下面的寡核苷酸被用于突变过程C12S，C16S，C20S5’-GTC TCT AAA AGC GAG ACA AAA AGC ACA AAG GCT AGC CCA AGACCC-3’，和5’-GGG TCT TGG GCT AGC CTT TGT GCT TTT TGT CTC GCTTTT AGA GAC-3’，C115S5’-GAG GAC CTC ACG TCT GAC ACC CTA C-3’和5’-GTA GGG TGT CAG ACG TGA GGT CCT C-3’；C274S，C283S5’-GGG CCC CTC AGC AAA GGA GAA GGT CTA TAC CTC TCG AGC GTA GATATA ATG-3’和5’-CAT TAT ATC TAC GCT CGA GAG GTA TAG ACC TTC TCCTTT GCT GAG GGG CCC-3’。
当具有C末端融合的内含肽区和壳多糖结合区(CBD)的融合蛋白与之相附着时，发生PyVP1-CallS的表达和纯化。为此，首先以IMPACT系统(New England Biolabs)的pCYB2载体为基础产生一个质粒。通过pCYB2的多克隆位点，按照标准的方法，用限制性位点Nde-I-XmaI(New England Biolabs的限制性内切酶)克隆DNA片段，它编码PyVP1-CallS蛋白。
下面的寡核苷酸被用于DNA片段的PCRvplNImp(5’-TAT ACA TATGGC CCC CAA AAG AAA AAG C-3’)，和vplCImp(5’-ATA TCC CGG GAGGAA ATA CAG TCT TTG TTT TTC C-3’)。用此PCR，野生型VP1蛋白的C末端氨基酸被同时从Gly383-Asn384转化进Pro383-Gly384，因为位于C末端的天门冬氨酸因其分裂特性对内含肽分裂系统是很不利的。上面提到的交换并不影响PyVP1蛋白在后续的后期装配中的基本特性。
pCYB2载体的tac启动子仅产生极少量融合蛋白的表达，因此，融合构建物(PyVP1-CallS)-内含肽-CBD是通过另一个PCR从pCYB2载体分离的，并用T7lac启动子(质粒pET21a，Novagen)经过NdeI-EcoRI限制性位点克隆进高表达pET载体中。用下面的寡核苷酸进行PCRvp1-NImp(5’-TAT ACA TAT GGC CCC CAA AAG AAA AAG C-3’)，和5’-ATA TGA ATT CCA GTC ATT GAA GCT GCC ACA AGG-3’。
如此产生的载体可以在高表达T7lac启动子帮助下，在大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)中表达融合蛋白(PyVP1-CallS)内含肽CBD。为此，转化的细胞在5升烧瓶中37℃培养，瓶中含2升LB培养基，直到培养物的OD600为2.0到2.5。通过培养基中的1mM IPTG诱导发生蛋白表达。然后，培养物在15℃培养20小时；低温使体内条件下融合蛋白中内含肽部分的消除达到最小化。通过离心收获细胞，在70ml重新悬浮缓冲液(20mM HEPES，1mM EDTA，100mM NaCl，5％(w/v)甘油，pH8.0)中重悬浮，并用高压匀浆化溶解。在48000g 60min离心粗提取物后，得到透明的细胞提取物。将此提取物在10℃温度下，以0.5ml/min流速置于10ml壳多糖亲和基质柱(New England Biolabs)上。然后，用3倍柱体积的重悬浮缓冲液、15倍柱体积的高离子强度冲洗缓冲液(20mM HEPES，1mM EDTA，2M NaCl，5％(w/v)甘油，pH8.0)冲洗，然后又是3倍柱体积的悬浮缓冲液；由此，所有不需要的大肠杆菌宿主蛋白被从壳多糖基质柱中去除。
在内含肽自分裂活性的帮助下，每次用50mM二硫苏糖醇(DTT)、50mM羟胺、或30mM DTT和30mM羟胺一起的重悬浮缓冲液脉冲(3倍柱体积)冲洗，引起固定在壳多糖基质柱上的(PyVP1-CallS)壳粒从融合蛋白上清除。为此，装载的壳多糖基质柱用提到的溶液之一10℃孵育14小时。用柱层析标准方法，PyVP1-CallS蛋白从壳多糖基质柱上完全释放并可以从壳多糖基质柱上分离，而融合蛋白的其它成分附着在基质柱上。适合于此，使用浓度在0.1和2.0M间的NaCl线性盐梯度。根据制造商的说明，通过用3倍柱体积的含SDS缓冲液(1％SDS(w/v)的重悬浮缓冲液)冲洗壳多糖材料再生壳多糖基质柱。
PyVP1-CallS蛋白的装配首先按照现有技术在已经描述的类似条件下进行(参考Salunke，Caspar & Garcea，生物物理学杂志(Biophys.J)56，S.887-900，1989)。在用10mM HEPES，50mM NaCl，0.5mM CaCl2，5％甘油，pH7.2，室温下72小时透析蛋白后，获得了病毒样衣壳。通过凝胶过滤(TSKGel G5000PWXL和TSKGel G6000PWXL凝胶柱，TosoHaas)，可以检测病毒样衣壳外壳，并可以与游离的、未装配的蛋白构建块分离。
在描述的方法中，PyVP1-CallS蛋白以可溶性五面体方式表达，并具有装配能力。图2a显示一个SDS凝胶柱以代表PyVP1-CallS的产生和纯化。图2b表示一个凝胶过滤试验，显示PyVP1-CallS蛋白可以在适当的条件下被装配成衣壳样结构。图2c在电镜图像的帮助下描述装配的衣壳。
该实施例显示PyVP1野生型蛋白可被修饰，所以，如果在蛋白外壳中没有半胱氨酸存在，按照现有的技术装配衣壳结构也是可能的。同时，本实施例显示了在内含肽为基础的纯化系统帮助下有效产生壳粒的可能性。实施例2荧光标记外壳蛋白PyVP1(CallS-T249C变异体)的产生、装配和特性为了壳粒的特异性标记，可将一个独特的半胱氨酸插入到蛋白的一个特殊区域。根据图3a中描述的蛋白三级结构，例如，249位苏氨酸被一个半胱氨酸代替。根据生产厂商的使用说明，采用寡核苷酸5’-GGA CGG GTG GGG TGC ACG TGC GTG CAG TG-3’和5’-CAC TGG AGGCAC GTG CAC CCC ACC CGT CC-3’，在QuickChange法(Stratagene)的帮助下进行诱变。蛋白的表达和纯化以实施例1类似的方法进行。
根据生产厂商说明书，纯化的蛋白采用染料荧光素-Maleimid或得克萨斯红-Maleimid(分子探针)进行标记。在249位半胱氨酸发生特异的结合；其特异性在图3b中显示。蛋白可类似于实施例1装配入衣壳中，如通过凝胶过滤分析(图3c)和电镜影像(图3d)所示。
以这种方法标记的衣壳在真核细胞(C2C12细胞)中孵育1小时。使用1000倍细胞数量的过量病毒样颗粒。孵育后用PBS冲洗附着的细胞，并借助细胞刮从培养瓶壁上移除。然后，脱落的细胞与SDS样品缓冲液混合，并加热至99℃进行5分钟。之后根据标准的方法，细胞融解物经SDS凝胶电泳分离。在此，壳粒的荧光标记蛋白成分在没有通常的凝胶染色的情况下仍变得清晰可见。在孵育指定时间后，细胞中已经发生了蛋白的大量降解(图4)。
这个实施例显示在一个安全位点上增加一个独特的半胱氨酸可以产生一个修饰的PyVP1-CallS蛋白，它可以被荧光素染料标记，并装配入壳粒中。来自这个蛋白变异体的壳粒可被摄取到真核细胞内部。这种摄取可被荧光素染料检测到。该标记并不影响蛋白的其他特性。实施例3具有和不具有荧光标记选择(2C/3C变异体)的含半胱氨酸外壳蛋白PyVP1的产生、装配和特性在PyVP1的20和115位氨基酸之间形成五面体内(intrapentameric)二硫键对于衣壳的装配和稳定是有益的。因此，就产生了一个PyVP1-CallS的变异体，它在两个氨基酸位置均包含半胱氨酸，而不是存在的丝氨酸。根据生产商的使用说明，采用Quickchange法(Stratagene)进行诱变。为此，采用下面的寡核苷酸S20C5’-GCA CAA AGG CTT GTC CAA GAC CCG C-3’和5’-GCG GGT CTTGGA CAA GCC TTT GTG C-3’。变异体S115C作为一个模板，根据实施例1，在PyVP1-CallS的生产过程中产生了一个中间产物。采用这种方法产生的变异体PyVP1-CallS-S20C-S115C在合适的位置具有两个半胱氨酸的五面体内的二硫键，在下面描述为PyVP1-2C。
从这个PyVP1-2C变异体开始，可以产生另一个变异体，它包括在249位增加的半胱氨酸，因此可以类似实施例2的PyVP1-CallS-T249C被特异地和中性地标记。在类似实施例2的Quickchange法(Stratagene)帮助下，采用那里描述的寡核苷酸进行诱变。
根据实施例1，为产生两种变异体，在溶剂中使用30mM DTT作为一个附加的添加物以便维持蛋白在还原状态。为将壳粒装配至衣壳中，在透析范围内分离DTT之后，壳粒中的二硫键发生氧化。图5显示了变异体PyVP1-2C的装配能力，其中装配可通过类似实施例1的透析方法附带地发生。
与PyVP1-CallS变异体相比，这个变异体的一个特殊特性是在氧化条件下将壳粒完全装配进入衣壳。在上述条件下，游离的、未装配的蛋白壳粒不再存在。借助上述两种所述的变异体，就可以将组分定量的封装入病毒样颗粒中。实施例4(PyVP1-RGD变异体)表面包含一个精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸盐激发序列的外壳蛋白PyVP1的产生、装配和特性从实施例2的PyVP1-CallS-T249C开始，可以产生两个变异体，它们在每个衣壳外壳上的一个独立环状结构中携带新的序列。这些新序列片断的特殊特性是出现Arg-Gly-Asp(RGD)序列。具有这些变异，就可以建立人工衣壳的细胞摄取机制，可与腺病毒的机制相比较。根据现有技术状况，对于这个病毒家族已知可以与细胞表面的整合素受体结合，使得细胞摄取腺病毒。
新序列基序的插入，一方面是在148和149位序列之间进行，另一方面是在293和295位氨基酸之间进行。根据结构相应区域位于衣壳的外面。
采用下面的寡核苷酸5’-CAA CAA ACC CAC AGA TAC AGT AAA CGGCAG CGG CAG CGG CAG CGG CAG CGG CAG TGC AAA AGG AAT TTC CAC TCCAGT G-3’和5’-CAC TGG AGT GGA AAT TCC TTT TGC ACT GCC GCT GCCGCT GCT GCC GCT GCC GCT GCC GTT TAC TGT ATC TGT GGG TTT GTT G-3’，借助Quickchange法(Stratagene)，在148/149位(为了后面变异体PyVP1-RGD148的产生)插入一个具有可交替变形的丝氨酸-甘氨酸基序的新环状片断。为在293/295位(为了后面变异体PyVP1-RGD293的产生)插入一个类似的环状片断，采用下面的寡核苷酸5’-GAT ATA ATGGGC TGG AGA GTT ACC GGC AGC GGC AGC GGC AGC AGC GGC AGC GGC AGTGGC TAT GAT GTC CAT CAC TGG AG-3’和5’-CTC CAG TGA TGG ACA TCATAG CCA CTG CCG CTG CCG CTG CTG CCG CTG CCG CTG CCG GTA ACT CTCCAG CCC ATT ATA TC-3’。第二步，使用寡核苷酸5’-CGG CAG CGG CAGCGG CAG CGG TCG TGG CGA TAG CGG CAG CGG CAG CGG CAG TG-3’和5’-CAC TGC CGC TGC CGC TGC CGC TAT CGC CAC GAC CGC TGC CGC TGCCGC TGC CG-3’以便在所述的两个变异体中将Arg-Gly-Asp序列插入到新产生的环状片断中。这样最后克隆后，变异体PyVP1-RGD148和PyVP1-RGD293在基因水平产生。
两种蛋白变异体的产生和纯化类似于实施例1。两种变异体装配进入衣壳在实施例1中给定的装配条件下成功完成，壳粒是天然的和有装配能力的。而且，类似于实施例2，在单一的半胱氨酸C249位置用荧光染料标记这些变异体是可能的。包含荧光标记壳粒的装配衣壳可在真核细胞(Caco-2型)中孵育。借助荧光显微镜通过荧光染料可以跟踪衣壳摄取进入细胞；不需要为此对细胞进行固定。如图6所示，衣壳被摄取入细胞。在此，PyVP1-RGD148变异体(图6b)较无RGD部分序列的可比较对照变异体PyVP1-CallS-T249C(图6a)更有效地摄取。因此，插入的RGD基序通过整合素-受体介导的内吞作用以有效的方式诱导衣壳的摄取。而且，实施例显示采用适当的组分可以控制衣壳摄取进细胞。
实施例5在天然唾液酸乳糖结合位点(PyVP1-R78W变异体)显示变化的外壳蛋白PyVP1的产生、装配和特性在变异体PyVP1-3C的基础上产生了另一个变异体，它的78位氨基酸精氨酸突变为色氨酸(PyVP1-3C-R78W)。精氨酸78的位置相当多地参与了在细胞表面天然病毒与唾液酸乳糖的结合，后者是多瘤病毒的天然受体。突变R78W对这种相互作用的抑制，即精氨酸改变为一个结构上不相容的色氨酸，可防止病毒颗粒经天然受体结合摄取进靶细胞。
根据生产厂商的使用说明，采用Quickchange法(Stratagene)进行指定的突变。因此使用下面的寡核苷酸5’-CTA TGG TTG GAG CTGGGG GAT TAA TTT G-3’和5’-CAA ATT AAT CCC CCA GCT CCA ACC ATAG-3’。得到的PyVP1-R78W变异体的产生、纯化和装配与实施例1类似。
与已出版的其他变异体相似，变异体PyVP1-R78W能装配入衣壳中。实施例显示衣壳的细胞趋向性可以通过改变衣壳表面结构来操纵。通过这样的方法，可以插入新的细胞趋向性，也可以消除当前的细胞趋向性。
实施例6混合衣壳I的产生和特性混合衣壳，即颗粒的产生是本发明的一个特别重要的特征，这些衣壳是以嵌合样方式由几种不同的分子物质构建而成。为了鉴定由不同外壳蛋白构建的混合衣壳，如实施例2所描述的，外壳蛋白PyVP1-CallS-T249C的变异体与单一的249位半胱氨酸偶联，一种方法用荧光染料荧光素-Maleimid，第二种方法用得克萨斯红-Maleimid。不同标记的衣壳等克分子比例混合，然后被装配。通过流式细胞仪(FACS)分析衣壳的形成。这种技术可在一个单一颗粒中检测不同的荧光类型。图7显示了等克分子装配衣壳的分析。出现了荧光标记的衣壳和游离的、未装配壳粒的组群(图7a/b)。当将荧光素荧光对得克萨斯红荧光以图表表示(图7c)时，观察到了一个同时携带两种荧光的颗粒组群。没有检测到仅以一种染料标记的颗粒，因为它们明显没有形成。
这个实施例显示，表现不同特性的多瘤病毒VP1外壳蛋白可以嵌合样的形式进行装配，因此可以形成特别显示两种外壳蛋白特性的病毒衣壳。除此之外，显示了一种高度敏感的检测和分析病毒衣壳成分的方法。
实施例7混合衣壳II的产生和特性为进一步证明本发明的优点，产生了一种PyVP1变异体，它是完全乏装配缺陷性的。为此，借助PCR，根据现有技术，在PyVP1-CallS-T249C氨基酸序列293和295位置之间插入了一个人工肽序列(序列GSGSG WTEHK SPDGR TYYYN TETKQ STWEK PDDGS GSG)。根据实施例1的说明，产生和纯化变异体。产生的变异体PyVP1-Def是一个天然的、五面体蛋白。但是，它是完全装配缺陷性的，并且不能在实施例1的标准装配条件下形成病毒样衣壳。这种装配缺陷性见凝胶过滤分析(图8a)。
根据实施例2，通过在249位的单一半胱氨酸，将装配缺陷性变异体PyVP1-Def用荧光素染料荧光素-Maleimid(分子探针)标记。然后，在变异体PyVP1-CallS存在下，两种成分以不同的化学计量比例进行装配。根据实施例1，装配通过透析的方法进行。在凝胶过滤分析(图8c)中测量荧光素在490nm的吸收度显示PyVP1-Def被构建入装配的衣壳中。在装配过程中两种衣壳组分化学计量比例的改变(图8c)表明，将装配缺陷性变异体PyVP1-Def包含在混合衣壳中的量与变异体的质量比率成比例。
这个实施例也显示了，在装配条件下可以形成由多瘤病毒VP1不同变异体组成的混合衣壳。而且，构建入衣壳的壳粒反映了起始条件化学计量质量比。所述的方法也可以用来将壳粒整合入衣壳结构中，而该结构是装配缺陷性的。
实施例8混合衣壳III的产生和特性无半胱氨酸的VP1变异体装配，如实施例2的PyVP1-CallS，可以具有缺点，即不是所有的，例如所用的50％的壳粒，可形成衣壳。除此之外，这些衣壳可能相对不稳定，并在分离后部分分解。这种缺点可以通过与含有半胱氨酸的变异体混合装配来弥补。
与采用PyVP1-CallS(图9a)的50％的装配能力相比，无半胱氨酸的变异体PyVP1-CallS-WW150显示装配能力下降为15％，而在与实施例3的PyVP1-2C和PyVP1-3C相似的适当的条件下，变异体VP1-wt的含半胱氨酸壳粒可完全装配入病毒衣壳中(图9b)。在装配条件下，变异体PyVP1-CallS-WW150和PyVP1-wt的等克分子混合物可产生嵌合样的混合病毒样衣壳。这个事实很明显，混合物完全地装配，不再检测到游离的壳粒(图9c)。
这个实施例也证实了以嵌合样方式构建的病毒衣壳的形成。而且，表明了含半胱氨酸与不含半胱氨酸的变异体结合的可能性，其中含半胱氨酸的壳粒，完全装配至稳定的病毒衣壳中，的特性被转染给整个衣壳。这种效应可使其他不含半胱氨酸壳粒的修饰在一个特定位置高度特异地插入的半胱氨酸残基上(例如采用PyVP1-CallS)进行的修饰，并将其新的功能插入到一个病毒衣壳中，这样可以避免无半胱氨酸装配的缺点(装配效率较低，更不稳定的衣壳)。
实施例9以病毒样衣壳转染细胞根据实施例2可以产生、装配和荧光标记变异体PyVP1-CallS-T249C。标记的衣壳摄入C2C12型真核细胞中后，可借助共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)在细胞内显示。因此，该PyVP1变异体为分析以嵌合样方式构建的、同质或异质(混合)装配衣壳的效率和摄取机制提供了可能性。因此，荧光标记的PyVP1-CallS-T249C被构建入衣壳颗粒中。
在
图10中，显示了由装配的PyVP1-CallS-T249C组成的衣壳摄取进入C2C12细胞中的一系列实验。除了衣壳染色(红色，染料得克萨斯红，分子探针)以外，晚期包涵体(绿色，染料荧光素-葡聚糖70kDa，分子探针)、细胞核(绿色，染料SYTO-16，分子探针)和溶酶体(兰色，染料LysoSensor兰-黄，分子探针)都可观察到。衣壳经内吞作用被摄取到细胞中，经过早期和晚期(15分钟后)包涵体，最后富集于溶酶体中(60分钟)。
该实施例证实借助以前描述的变异体分析组分的特性是可能的，这些分析可能也包括衣壳的细胞内定位和激活机制。因此，显示了一种通过采用标记分析和描述人工合成的、嵌合样衣壳的生物学特性的可能性，标记本身是中性的，对这些特性没有影响。
实施例10以DNA和病毒样衣壳的复合体转染细胞为证实通过病毒样衣壳将DNA传递至真核细胞，100μl蛋白PyVP1-3C(1mg/ml于20mM HEPES pH7.2，100mM NaCl，10mM DTT，1mMEDTA，5％甘油)溶液与7.5μl质粒pEGFP-N1(Clontech)以及100μl透析缓冲液(20mM乙酸钠，pH5.0，100mM NaCl，1mM CaCl2，5％甘油)混合，并在室温下通过经常更换透析缓冲液透析4天。为了产生转染培养基，100μl这种反应混合物与300μl Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)+1μM氯喹混合。为了进行转染实验，使用NIH-3T3细胞，于前一天以每孔10000细胞的密度接种于一个12孔板上。转染时，细胞用PBS(磷酸缓冲盐水)冲洗，每孔与400μl转染培养基混合。细胞在37℃，5％CO2孵育1小时，然后用PBS冲洗，用完全培养基(DMEM+10％FBS)在37℃和5％CO2继续孵育48小时。经过这段时间后，通过一个报告基因的表达可检测到成功的转染。在此使用的质粒pEGFP-N1允许表达GFP(绿荧光素蛋白)，由于其绿色荧光可以在细胞中被检测到。根据在此描述的方案，每孔平均大约20个细胞可被鉴定确实产生了报告基因GFP。
这个实施例显示使用在此描述的转运系统，包括PyVP1-3C，可成功的将DNA传递到真核细胞中。另外，插入的DNA可在细胞中释放，报告基因可被正确地表达。
实施例11李斯特赖氨酸O(LLO)的产生和特性如在实施例7中明确的，大量产生的病毒样衣壳在摄入到真核细胞后在溶酶体中富集，最后被溶解。颗粒从内涵体小室中的释放可通过加入细胞溶解素来诱导。这样一个模型来自单核细胞增多性李斯特杆菌的李斯特赖氨酸O(LLO)。
根据标准的方法，借助PCR，从单核细胞增多性李斯特杆菌的一个基因组DNA片断扩增LLO基因。为此，借助寡核苷酸5’-TAT AGA CGTCCG ATG CAT CTG CAT TCA ATA AAG AAA ATT-3’和5’-TAC TTA AGG CTGCGA TTG GAT TAT CTA CAC TAT TAC TA-3’在载体pTIP中进行克隆。这个pTIP载体是内含肽表达载体的一个衍生物，在实施例1中已有说明，以pET21a为基础另外插入了富含脯氨酸的序列。构建载体以便富含脯氨酸的序列能被融合到基因的5’或3’末端，可选择的是，经一个多克隆位点插入。富含脯氨酸的序列主要包括序列Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro。
在第二个PCR中，基因片断从pTIP载体中扩增，并克隆进pET34b载体(Novagen)中。为此，使用寡核苷酸5’-GCC GCC ACC TCC ACC GCCAC-3’和5’-ATT AGG GTT CGA TTG GAT TAT CTA CAC TAT TAC-3’。载体用Srf I(Stratagene)钝端切割，DNA片断将钝端连接进载体pET34b中。产生的构建物可以表达LLO蛋白，该蛋白通过富含脯氨酸的序列标记为一个具有纤维素结合区的N-末端融合蛋白。结合区可借助肠激酶在成功地亲和纯化后被蛋白酶溶解性分离。在1mM IPTG诱导后通过25℃培养转化BL21(DE3)细胞可产生融合蛋白。根据实施例1进行细胞匀浆。20mM HEPES，200mM NaCl，pH7.0在此用作重新悬浮缓冲液。为去除细菌DNA，细胞提取物与5mM MgCl2和0.1U Benzonase混合，并在25℃孵育30分钟。
然后，根据生产厂商的使用说明将细胞提取物置于纤维素基质(Novagen)上进行融合蛋白的纯化。用1倍柱体积的乙烯甘油(Merck)洗脱融合蛋白。洗脱的蛋白立即用重悬缓冲液进行透析。根据生产厂商的使用说明，采用肠激酶去除融合蛋白上的纤维素结合区。
图11a显示了一个SDS电泳凝胶，它记录了LLO的产生和纯化。蛋白的活性在
图11b中描述。蛋白在适当的溶剂条件下(pH＜6.0)可诱导小孔进入含胆固醇的脂质双层膜中。这在合成的、根据标准方法产生的、含胆固醇的脂质体中有显示。在此，荧光染料(钙黄绿素)可从合成的脂质体中释放，并在溶液中发现可测量荧光信号增加(
图11b)。该实施例显示，蛋白LLO可以活性形式重组地产生。而且，已经显示当LLO出现在内涵体中时，可溶解生物膜。连同实施例1至7的衣壳，这种特性可被用于释放摄入进内涵体的衣壳。
序列表<110>ACGT前基因组公司(ACGT ProGenomics AG)<120>分子物质模块转运系统及其产生方法和用途<130>P12605<140>PCT/EP00/10876<141>2001-11-03<150>PCT/EP00/10876<151>2000-11-03<150>DE 199 52 957.4<151>1999-11-03<160>22<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1152<212>DNA<213>人工序列<220><223>多瘤病毒包衣蛋白VP1(PyVP1-CallS)的变异体<220><221>CDS<222>(1)..(1152)<223><400>1atg gcc ccc aaa aga aaa agc ggc gtc tct aaa agc gag aca aaa agc 48Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 510 15aca aag gct agc cca aga ccc gca ccc gtt ccc aaa ctg ctt att aaa 96Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30ggg ggt atg gag gtg ctg gac ctt gtg aca ggg cca gac agt gtg aca 144Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45gaa ata gaa gct ttt ctg aac ccc aga atg ggg cag cca ccc acc cct 192Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60gaa agc cta aca gag gga ggg caa tac tat ggt tgg agc aga ggg att 240Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80aat ttg gct aca tca gat aca gag gat tcc cca gga aat aat aca ctt 288Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95ccc aca tgg agt atg gca aag ctc cag ctt ccc atg ctc aat gag gac 336Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110ctc acg tct gac acc cta caa atg tgg gag gca gtc tca gtg aaa acc 384Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125gag gtg gtg ggc tct ggc tca ctg tta gat gtg cat ggg ttc aac aaa 432Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140ccc aca gat aca gta aac aca aaa gga att tcc act cca gtg gaa ggc 480Pro Thr Asp Thr Val Asn Thr Lys Gly Ile Ser Thr Pro Val Glu Gly145 150 155 160agc caa tat cat gtg ttt gct gtg ggc ggg gaa ccg ctt gac ctc cag 528Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly Glu Pro Leu Asp Leu Gln165 170 175gga ctt gtg aca gat gcc aga aca aaa tac aag gaa gaa ggg gta gta 576Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr Lys Glu Glu Gly Val Val180 185 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tat ttc aaa atc acc ctg aga aaa aga tgg gtc aaa aat ccc tat 960Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro Tyr305 310 315 320ccc atg gcc tcc ctc ata agt tcc ctt ttc aac aac atg ctc ccc caa 1008Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro Gln325 330 335gtg cag ggc caa ccc atg gaa ggg gag aac acc cag gta gag gag gtt 1056Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu Val340 345 350aga gtg tat gat ggg act gaa cct gta ccg ggg gac cct gat atg acg 1104Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met Thr355 360 365cgc tat gtt gac cgc ttt gga aaa aca aag act gta ttt cct ccc ggg 1152Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro Gly370 375 380<210>2<211>384<212>PRT<213>人工序列<220><223>多瘤病毒包衣蛋白VP1(PyVP1-CallS)的变异体<400>2Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 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Leu Asp Glu Asn Gly Val Gly Pro260 265 270Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser Ser Val Asp Ile Met Gly275 280 285Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His His Trp Arg Gly Leu Pro290 295 300Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro Tyr305 310 315 320Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro Gln325 330 335Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu Val340 345 350Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met Thr355 360 365Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro Gly370 375 380<210>3<211>1152<212>DNA<213>人工序列<220><223>多瘤病毒包衣蛋白VP1(PyVP1-CallS-T249C)的变异体<220><221>CDS<222>(1)..(1152)<223><400>3atg gcc ccc aaa aga aaa agc ggc gtc tct aaa agc gag aca aaa agc48Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15aca aag gct agc cca aga ccc gca ccc gtt ccc aaa ctg ctt att aaa96Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30ggg ggt atg gag gtg ctg gac ctt gtg aca ggg cca gac agt gtg aca144Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45gaa ata gaa gct ttt ctg aac ccc aga atg ggg cag cca ccc acc cct192Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60gaa agc cta aca gag gga ggg caa tac tat ggt tgg agc aga ggg att240Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80aat ttg gct aca tca gat aca gag gat tcc cca gga aat aat aca ctt 288Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Ash Thr Leu85 90 95ccc aca tgg agt atg gca aag ctc cag ctt ccc atg ctc aat gag gac 336Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110ctc acg tct gac acc cta caa atg tgg gag gca gtc tca gtg aaa acc 384Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125gag gtg gtg ggc tct ggc tca ctg tta gat gtg cat ggg ttc aac aaa 432Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140ccc aca gat aca gta aac aca aaa gga att tcc act cca gtg gaa ggc 480Pro Thr Asp Thr Val Asn Thr Lys Gly Ile Ser Thr Pro Val Glu Gly145 150 155 160agc caa tat cat gtg ttt gct gtg ggc ggg gaa ccg ctt gac ctc cag 528Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly Glu Pro Leu Asp Leu Gln165 170 175gga ctt gtg aca gat gcc aga aca aaa tac aag gaa gaa ggg gta gta 576Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr Lys Glu Glu Gly Val Val180 185 190aca atc aaa aca atc aca aag aag gac atg gtc aac aaa gac caa gtc 624Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met Val Asn Lys Asp Gln Val195 200 205ctg aat cca att agc aag gcc aag ctg gat aag gac gga atg tat cca 672Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp Lys Asp Gly Met Tyr Pro210 215 220gtt gaa atc tgg cat cca gat cca gca aaa aat gag aac aca agg tac 720Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys Asn Glu Asn Thr Arg Tyr225 230 235 240ttt ggc aat tac act gga ggc acg tgc acc cca ccc gtc ctg cag ttc 768Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Pro Pro Val Leu Gln Phe245 250 255aca aac acc ctg aca act gtg ctc cta gat gaa aat gga gtt ggg ccc 816Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Asn Gly Val Gly Pro260 265 270ctc agc aaa gga gaa ggt cta tac ctc tcg agc gta gat ata atg ggc 864Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser Ser Val Asp Ile Met Gly275 280 285tgg aga gtt aca aga aac tat gat gtc cat cac tgg aga ggg ctt ccc 912Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His His Trp Arg Gly Leu Pro290 295 300aga tat ttc aaa atc acc ctg aga aaa aga tgg gtc aaa aat ccc tat 960Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro Tyr305 310 315 320ccc atg gcc tcc ctc ata agt tcc ctt ttc aac aac atg ctc ccc caa 1008Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro Gln325 330 335gtg cag ggc caa ccc atg gaa ggg gag aac acc cag gta gag gag gtt 1056Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu Val340 345 350aga gtg tat gat ggg act gaa cct gta ccg ggg gac cct gat atg acg 1104Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met Thr355 360 365cgc tat gtt gac cgc ttt gga aaa aca aag act gta ttt cct ccc ggg 1152Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro Gly370 375 380<210>4<211>384<212>PRT<213>人工序列<220><223>多瘤病毒包衣蛋白VP1(PyVP1-CallS-T249C)的变异体<400>4Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140Pro Thr Asp Thr Val Asn Thr Lys Gly Ile Ser Thr Pro Val Glu Gly145 150 155 160Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly Glu Pro Leu Asp Leu Gln165 170 175Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr Lys Glu Glu 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672Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp Lys Asp Gly Met Tyr Pro210 215 220gtt gaa atc tgg cat cca gat cca gca aaa aat gag aac aca agg tac 720Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys Asn Glu Asn Thr Arg Tyr225 230 235 240ttt ggc aat tac act gga ggc acg aca acc cca ccc gtc ctg cag ttc 768Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Pro Pro Val Leu Gln Phe245 250 255aca aac acc ctg aca act gtg ctc cta gat gaa aat gga gtt ggg ccc 816Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Asn Gly Val Gly Pro260 265 270ctc agc aaa gga gaa ggt cta tac ctc tcg agc gta gat ata atg ggc 864Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser Ser Val Asp Ile Met Gly275 280 285tgg aga gtt aca aga aac tat gat gtc cat cac tgg aga ggg ctt ccc 912Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His His Trp Arg Gly Leu Pro290 295 300aga tat ttc aaa atc acc ctg aga aaa aga tgg gtc aaa aat ccc tat 960Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro Tyr305 310 315 320ccc atg gcc tcc ctc ata agt tcc ctt ttc aac aac atg ctc ccc caa 1008Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro Gln325 330 335gtg cag ggc caa ccc atg gaa ggg gag aac acc cag gta gag gag gtt 1056Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu Val340 345 350aga gtg tat gat ggg act gaa cct gta ccg ggg gac cct gat atg acg 1104Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met Thr355 360 365cgc tat gtt gac cgc ttt gga aaa aca aag act gta ttt cct ccc ggg 1152Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro Gly370375 380<210>6<211>384<212>PRT<213>人工序列<220><223>多瘤病毒包衣蛋白VP1(PyVP1--2C)的变异体<400>6Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15Thr Lys Ala Cys Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 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Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro Tyr305 310 315 320Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro Gln325 330 335Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu Val340 345 350Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met Thr355 360 365Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro Gly370 375 380<210>7<211>1152<212>DNA<213>人工序列<220><223>多瘤病毒包衣蛋白VP1(PyVP1-3C)的变异体<220><221>CDS<222>(1)..(1152)<223><400>7atg gcc ccc aaa aga aaa agc ggc gtc tct aaa agc gag aca aaa agc 48Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15aca aag gcc tgt cca aga ccc gca ccc gtt ccc aaa ctg ctt att aaa 96Thr Lys Ala Cys Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30ggg ggt atg gag gtg ctg gac ctt gtg aca ggg cca gac agt gtg aca 144Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45gaa ata gaa gct ttt ctg aac ccc aga atg ggg cag cca ccc acc cct 192Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr 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Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Trp Gly Ile65 70 75 80Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110Leu Thr Cys Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140Pro Thr Asp Thr Val Asn Thr Lys Gly Ile Ser Thr Pro Val Glu Gly145 150 155 160Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly Glu Pro Leu Asp Leu Gln165 170 175Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr Lys Glu Glu Gly Val Val180 185 190Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met Val Asn Lys Asp Gln Val195 200 205Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp Lys Asp Gly Met Tyr Pro210 215 220Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys Asn Glu Asn Thr Arg Tyr225 230 235 240Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Pro Pro Val Leu Gln Phe245 250 255Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Asn Gly Val Gly Pro260 265 270Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser Ser Val Asp Ile Met Gly275 280 285Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His His Trp Arg Gly Leu Pro290 295 300Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro Tyr305 310 315 320Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro Gln325 330 335Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu Val340 345 350Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met Thr355 360 365Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro Gly370 375 380<210>15<211>1263<212>DNA<213>人工序列<220><223>多瘤病毒包衣蛋白VP1(PyVP1--Def)的变异体<220><221>CDS<222>(1)..(1263)<223><220><221>misc_feature<222>(868)..(981)<223>插入一个肽序列<400>15atg gcc ccc aaa aga aaa agc ggc gtc tct aaa agc gag aca aaa agc 48Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15aca aag gct agc cca aga ccc gca ccc gtt ccc aaa ctg ctt att aaa 96Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30ggg ggt atg gag gtg ctg gac ctt gtg aca ggg cca gac agt gtg aca 144Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45gaa ata gaa gct ttt ctg aac ccc aga atg ggg cag cca ccc acc cct 192Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60gaa agc cta aca gag gga ggg caa tac tat ggt tgg agc aga ggg att 240Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80aat ttg gct aca tca gat aca gag gat tcc cca gga aat aat aca ctt 288Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95ccc aca tgg agt atg gca aag ctc cag ctt ccc atg ctc aat gag gac 336Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110ctc acg tct gac acc cta caa atg tgg gag gca gtc tca gtg aaa acc 384Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125gag gtg gtg ggc tct ggc tca ctg tta gat gtg cat ggg ttc aac aaa 432Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140ccc aca gat aca gta aac aca aaa gga att tcc act cca gtg gaa ggc 480Pro Thr Asp Thr Val Asn Thr Lys Gly Ile Ser Thr Pro Val Glu Gly145 150 155 160agc caa tat cat gtg ttt gct gtg ggc ggg gaa ccg ctt gac ctc cag 528Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly Glu Pro Leu Asp Leu Gln165 170 175gga ctt gtg aca gat gcc aga aca aaa tac aag gaa gaa ggg gta gta 576Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr Lys Glu Glu Gly Val Val180 185 190aca atc aaa aca atc aca aag aag gac atg gtc aac aaa gac caa gtc 624Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met Val Asn Lys Asp Gln Val195 200 205ctg aat cca att agc aag gcc aag ctg gat aag gac gga atg tat cca 672Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp Lys Asp Gly Met Tyr Pro210 215 220gtt gaa atc tgg cat cca gat cca gca aaa aat gag aac aca agg tac 720Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys Asn Glu Asn Thr Arg Tyr225 230 235 240ttt ggc aat tac act gga ggc acg tgc acc cca ccc gtc ctg cag ttc 768Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Pro Pro Val Leu Gln Phe245 250 255aca aac acc ctg aca act gtg ctc cta gat gaa aat gga gtt ggg ccc 816Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Asn Gly Val Gly Pro260 265 270ctc agc aaa gga gaa ggt cta tac ctc tcg agc gta gat ata atg ggc 864Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser Ser Val Asp Ile Met Gly275 280 285tgg ggc agc ggc agc ggc tgg aca gaa cat aaa tca cct gat gga agg 912Trp Gly Ser Gly Ser Gly Trp Thr Glu His Lys Ser Pro Asp Gly Arg290 295 300act tat tat tac aat act gaa aca aaa cag tct acc tgg gaa aag cca 960Thr Tyr Tyr Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp Glu Lys Pro305 310 315 320gat gat ggt agt ggt agc ggc gtt aca aga aac tat gat gtc cat cac 1008Asp Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His His325 330 335tgg aga ggg ctt ccc aga tat ttc aaa atc acc ctg aga aaa aga tgg 1056Trp Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp340 345 350gtc aaa aat ccc tat ccc atg gcc tcc ctc ata agt tcc ctt ttc aac 1104Val Lys Asn Pro Tyr Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn355 360 365aac atg ctc ccc caa gtg cag ggc caa ccc atg gaa ggg gag aac acc1152Asn Met Leu Pro Gln Val Gln Gly Gln Pro Met Glu 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Arg Asn Tyr Asp Val His His325 330 335Trp Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp340 345 350Val Lys Asn Pro Tyr Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn355 360 365Asn Met Leu Pro Gln Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr370 375 380Gln Val Glu Glu Val Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly385 390 395 400Asp Pro Asp Met Thr Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr405 410 415Val Phe Pro Pro Gly420<210>17<211>1581<212>DNA<213>人工序列<220><223>李斯特溶解素O(LLO)的变异体<220><221>CDS<222>(1)..(1581)<223><220><221>misc_feature<222>(1)..(63)<223>加入一个含脯氨酸的序列<400>17atg ccg cca cct cca ccg cca cct ccg tta cca ggc cta ggc cgg cgt48Met Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Leu Gly Arg Arg1 5 10 15ggg cta gcg acg tcc gat gca tct gca ttc aat aaa gaa aat tta att96Gly Leu Ala Thr Ser Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Leu Ile20 25 30tca tcc atg gca cca cca gca tct ccg cct gca agt cct aag acg cca 144Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro35 40 45atc gaa aag aaa cac gcg gat gaa atc gat aag tat ata caa gga ttg 192Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly Leu50 55 60gat tac aat aaa aac aat gta tta gta tac cac gga gat gca gtg aca 240Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr65 70 75 80aat gtg ccg cca aga aaa ggt tat aaa gat gga aat gaa tat atc gtt 288Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Val85 90 95gtg gag aaa aag aag aaa tcc atc aat caa aat aat gca gat atc caa 336Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile Gln100 105 110gtt gtg aat gca att tcg agc cta aca tat cca ggt gct ctc gtg aaa 384Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val Lys115 120 125gcg aat tcg gaa tta gta gaa aat caa ccc gat gtt ctt cct gtc aaa 432Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val Lys130 135 140cgt gat tca tta aca ctt agc att gat ttg cca gga atg act aat caa 480Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn Gln145 150 155 160gac aat aaa att gtt gta aaa aat gct act aaa tcg aac gtt aac aac 528Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn165 170 175gca gta aat aca tta gtg gaa aga tgg aat gaa aaa tat gct caa gct 576Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala180 185 190tat cca aat gta agt gca aaa att gat tat gat gac gaa atg gct tac 624Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala Tyr195 200 205agt gaa tcg caa tta att gca aaa ttt ggt acg gca ttt aaa gct gta 672Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala Val210 215 220aat aat agc ttg aat gta aac ttc ggc gca atc agt gaa ggg aaa atg 720Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys Met225 230 235 240caa gaa gaa gtc att agt ttt aaa caa att tac tat aac gtg aat gtt 768Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn Val245 250 255aat gaa cct aca aga cct tcc aga ttt ttc ggc aaa gct gtt act aaa 816Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr Lys260 265 270gag cag ttg caa gcg ctt gga gtg aat gca gaa aat cct cct gca tat 864Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala Tyr275 280 285atc tca agt gtg gca tat ggc cgt caa gtt tat ttg aaa tta tca act 912Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser Thr290 295 300aat tcc cat agt acc aaa gta aaa gct gct ttt gac gct gcc gta agt 960Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ser305 310 315 320ggg aaa tct gtc tca ggt gat gta gaa ctg aca aat atc atc aaa aat 1008Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys Asn325 330 335tct tcc ttc aaa gcc gta att tac ggt ggc tcc gca aaa gat gaa gtt 1056Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu Val340 345 350caa atc atc gac ggt aac ctc gga gac tta cga gat att ttg aaa aaa 1104Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys Lys355 360 365ggt gct act ttt aac cgg gaa aca cca gga gtt ccc att gcc tat aca 1152Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr Thr370 375 380aca aac ttc tta aaa gac aat gaa tta gct gtt att aaa aac aac tca 1200Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile Lys Asn Asn Ser385 390 395 400gaa tat att gaa aca act tca aaa gct tat aca gat gga aaa atc aac 1248Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile Asn405 410 415atc gat cac tct gga gga tac gtt gct caa ttc aac atc tct tgg gat 1296Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp Asp420 425 430gaa ata aat tat gat cct gaa ggt aac gaa att gtt caa cat aaa aac 1344Glu Ile Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val Gln His Lys Asn435 440 445tgg agc gaa aac aat aaa agt aag cta gct cat ttc aca tcg tcc atc1392Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser Ile450 455 460tat ttg cca ggt aac gca aga aat att aat gtt tac gct aaa gaa tgc1440Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr Ala Lys Glu Cys465 470 475 480act ggt tta gct tgg gaa tgg tgg aga acg gta att gat gac cgg aac1488Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile Asp Asp Arg Asn485 490 495cta ccg ctt gtg aaa aat aga aat atc tcc atc tgg ggc act aca ctt1536Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu500 505 510Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Ser Val Asp Asn Pro Ile Glu Pro Gly515 520 525<210>18<211>527<212>PRT<213>人工序列<220><223>李斯特溶解素O(LLO)的变异体<220><221>misc_feature<222>(1)..(63)<223>加入一个富含脯氨酸序列<400>18Met Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Leu Gly Arg Arg1 5 10 15Gly Leu Ala Thr Ser Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Leu Ile20 25 30Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro35 40 45Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly Leu50 55 60Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr65 70 75 80Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Val85 90 95Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile Gln100 105 110Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val Lys115 120 125Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val Lys130 135 140Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn Gln145 150 155 160Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn165 170 175Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala180 185 190Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala Tyr195 200 205Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala Val210 215 220Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys Met225 230 235 240Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn Val245 250 255Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr Lys260 265 270Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala Tyr275 280 285Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser Thr290 295 300Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ser305 310 315 320Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys Asn325 330 335Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu Val340 345 350Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys Lys355 360 365Gly 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Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15aca aag gct agc cca aga ccc gca ccc gtt ccc aaa ctg ctt att aaa 96Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30ggg ggt atg gag gtg ctg gac ctt gtg aca ggg cca gac agt gtg aca 144Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45gaa ata gaa gct ttt ctg aac ccc aga atg ggg cag cca ccc acc cct 192Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60gaa agc cta aca gag gga ggg caa tac tat ggt tgg agc aga ggg att 240Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80aat ttg gct aca tca gat aca gag gat tcc cca gga aat aat aca ctt 288Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95ccc aca tgg agt atg gca aag ctc cag ctt ccc atg ctc aat gag gac 336Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110ctc acg tct gac acc cta caa atg tgg gag gca gtc tca gtg aaa acc 384Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125gag gtg gtg ggc tct ggc tca ctg tta gat gtg cat ggg ttc aac aaa 432Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140ccc aca gat aca ggc agc ggc agc ggc tgg aca gaa cat aaa tca cct 480Pro Thr Asp Thr Gly Ser Gly Ser Gly Trp Thr Glu His Lys Ser Pro145 150 155 160gat gga agg act tat tat tac aat act gaa aca aaa cag tct acc tgg 528Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp165 170 175gaa aag cca gat gat ggt agt ggt agc ggc gta aac aca aaa gga att 576Glu Lys Pro Asp Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Asn Thr Lys Gly Ile180 185 190tcc act cca gtg gaa ggc agc caa tat cat gtg ttt gct gtg ggc ggg 624Ser Thr Pro Val Glu Gly Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly195 200 205gaa ccg ctt gac ctc cag gga ctt gtg aca gat gcc aga aca aaa tac 672Glu Pro Leu Asp Leu Gln Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr210 215 220aag gaa gaa ggg gta gta aca atc aaa aca atc aca aag aag gac atg 720Lys Glu Glu Gly Val Val Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp 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权利要求
1.分子物质的转运系统，它含有重组产生的基于氨基酸的部分单位，包括-至少两个各自不同地修饰一次的部分单位，和/或-一个或数个至少两次不同修饰的部分单位，和-可选择地未修饰的部分单位，其中的部分单位能够装配成一个类嵌合体的转运系统，分子物质可被封装进转运系统中。
2.根据权利要求1所述的转运系统，其特征在于重组产生的、修饰的部分单位是单体、二聚体或低聚体单位，它们来源于病毒衣壳、细菌噬菌体衣壳或一个具有内部空腔的大分子蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的转运系统，其特征在于重组产生的、修饰的部分单位或未修饰的部分单位来源于蛋白酶体或陪伴分子，或来自一个或多个以下家族代表的外壳蛋白，这些家族是腺病毒科、沙粒病毒科、Artervirus、星形病毒科、Bacilloviridae、杆状病毒科、Badnavirus、Barnaviridae、双RNA病毒科、雀麦花叶病毒、斑雅病毒科、杯状病毒科、毛状病毒组、荷兰石竹潜伏病毒、花椰菜病毒、圆环病毒科、多形多核病毒、豇豆花叶病毒科、冠状病毒科、覆盖噬菌体科、囊状噬菌体科、香石竹病毒、Enamovirus、线状病毒科、黄病毒科、真菌传棒状病毒组、Fuselloviridae、杜仲病毒科、 双生病毒组、嗜肝DNA病毒科、疱疹病毒科、大麦病毒、Hypoviridae、Idaeovirus、丝状噬菌体科、虹色病毒科、轻小病毒科、脂毛病毒科、黄矮病毒组、Machlomovirus、微小噬菌体科、微小病毒、肌病毒科、坏死病毒、野田村病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、副粘病毒科、分病毒科、细小病毒科、藻DNA病毒科、细小核糖核酸病毒科、原生病毒科、短尾病毒科、多DNA病毒科、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒组、痘病病毒科、呼肠孤病毒属、反转录病毒科、棒状病毒科、根瘤病毒、Sequiviridae、长尾病毒科、南方菜豆花叶病毒、复层病毒科、水稻条纹叶枯病毒组、四病毒科、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、批盖病毒科、番茄丛矮病毒科、全病毒科、Trichovirus、芜箐病毒、或Umbravirus。
4.根据一个或数个前述权利要求所述的转运系统，其特征在于所述的转运系统含有重组产生的、修饰的多瘤病毒VP1蛋白的部分单位。
5.根据一个或数个前述权利要求中的转运系统，其特征在于单链或双链DNA、单链或双链RNA、肽、肽类激素、蛋白、蛋白结构区、糖蛋白、核酶、PNA(肽核酸)、药剂、核苷酸、激素、脂类或碳水化合物，可以作为分子物质被封装。
6.根据一个或数个前述权利要求中所述的转运系统，其特征在于封装在转运系统内的单链或双链DNA、单链或双链RNA，编码用信号序列提供的蛋白，以便蛋白被转运进核、线粒体、内质网，或转运出细胞外。
7.根据一个或数个前述权利要求中所述的转运系统，其特征在于封装在转运系统中的物质用一个信号分子来提供，以便它们被转运进核、线粒体、内质网，或转运出细胞外。
8.根据一个或数个前述权利要求中所述的转运系统，其特征在于通过在氨基末端融合富含甘氨酸和丙氨酸的序列，由封装的单链或双链DNA、或单链或双链RNA编码的蛋白，或封装的蛋白，或外壳的一个组分的蛋白的细胞降解速度降低，这样在活生物体内就不发生或有所降低对免疫系统的刺激。
9.根据一个或数个前述权利要求中所述的转运系统，其特征在于所述的转运系统被一个外壳覆盖，以防止生物体的免疫反应。
10.根据一个或数个前述权利要求中所述的转运系统，其特征在于所述的外壳由聚乙二醇组成，或以一个合成产生的脂质膜的形式出现。
11.根据一个或数个前述权利要求中所述的转运系统，其特征在于重组产生的部分单位是在末端/目的位点和/或在部分单位的序列内，通过点突变或通过插入、去除或改变一个或多个肽或蛋白序列或蛋白结构区进行修饰，或重组产生的部分单位的修饰方式是，使它们被靶细胞有效地摄入和/或指向靶细胞，和/或分子物质能被较好地结合并与部分单位关联。
12.根据一个或数个前述权利要求中所述的转运系统，其特征在于所述的转运系统显示至少一个在转运系统内部定位的区域被修饰的部分单位，这样分子物质能更好地与部分单位结合或关联。
13.根据一个或数个前述权利要求所述的转运系统，其特征在于重组产生的部分单位是通过点突变和/或通过与肽类、肽激素、蛋白质、蛋白质结构区、糖蛋白、脂类或碳水化合物结合而被修饰，它们可以以这种方式在所选择的细胞类型中被特异地摄取。
14.根据一个或数个前述权利要求所述的转运系统，其特征在于所述的转运系统显示至少有一个在环状结构中携带一个RGD序列的部分单位，该结构位于转运系统外部，能使转运系统通过整合素受体介导的内吞作用被摄入到靶细胞中。
15.根据一个或数个前述权利要求所述的转运系统，其特征在于用至少一个或几个蛋白、一个或几个蛋白结构区、一个或几个肽、一个或几个dendrimers、或疏水或碱性的多聚体修饰重组产生的部分单位，以此方式使转运系统或其一部分能通过内涵体膜。
16.根据权利要求15所述的转运系统，其特征在于细菌溶细胞素或病毒蛋白被作为蛋白使用，细菌毒素的转位结构区被用作蛋白结构区。
17.根据一个或数个前述权利要求所述的转运系统，其特征在于重组产生的部分单位可用一个荧光染料、寡核苷酸、肽类、肽激素、脂类、脂肪酸或碳水化合物标记。
18.一个或数个前述权利要求中所述的转运系统的产生方法，具有以下步骤-部分单位的重组体表达，-通过溶解宿主细胞释放部分单位，-以所需的化学计量关系在部分单位之间建立接触，以便用嵌合体样方式组成/或装配转运系统，和-在装配之前或期间，可选择性地与分子物质接触，以将分子物质封装在转运系统内。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于重组产生的修饰的部分单位采用适当的溶剂条件，以选定的化学计量关系装配，通过这一方式分子转运系统的功能特征就能被检测/确定/控制。
20.根据权利要求1至17中任何一个所述的转运系统用于在细胞中传递分子物质的用途。
21.根据权利要求1至17中任何一个所述的转运系统用于在真核细胞中传递DNA的用途。
22.根据权利要求20所述的用途，其中加入溶细胞素，优选李斯特溶解素O，以便从细胞溶酶体中释放转运系统。
23.根据权利要求20所述的用途，其特征在于分子转运系统的部分单位用荧光染料标记，使得分子转运系统可以在细胞内部定位。
24.药物组合物，它含有根据权利要求1至17中的任何一个或多个所述的一个或多个转运系统，以及普通的制药学上可接受的添加物和佐剂。
全文摘要
本发明涉及分子物质的转运系统,包括一个重组部分单位(单一组分)的嵌合体。本发明进一步涉及了分子转运系统的产生及其用途。
文档编号C12N15/09GK1384876SQ00815127
公开日2002年12月11日 申请日期2000年11月3日 优先权日1999年11月3日
发明者G·伯姆, R·鲁道夫, U·施密特, D·埃瑟 申请人:Acgt前基因组公司