专利名称：用于提高核黄素产量的遗传菌株的优化的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组产生核黄素的方法。由于对阿舒囊霉属(Ashbya)生物的核黄素合成基因或基因的组合以及它们的表达进行了特别选择，核黄素在这些生物中的产量得到了提高。
维生素B2，也称作核黄素，所有的植物和许多微生物都能够产生这种物质。由于人类和动物不能合成核黄素，因此核黄素是必需的。核黄素在新陈代谢中起着重要的作用。例如它参与碳水化合物的利用。维生素B2的缺乏会导致口和咽粘膜的炎症、皮肤襞搔痒、炎症及类似的皮肤损伤、结膜炎、视觉灵敏度下降及角膜浑浊。婴幼儿体内缺乏B2会导致生长延缓和体重下降。因此维生素B2具有重要的经济意义，例如它可在维生素缺乏的时候作为维生素补充物并且可以作为饲料添加剂。它也可以添加到许多食品中去。此外，维生素B2还可用作如蛋黄酱、冰淇淋和牛奶冻等食品的着色剂。
维生素B2可化学制备或用微生物来产生(参见如B.Kurth等，1996，见Ullmann’s Encyclopedia of industrial chemistry，VCH Weinheim一书中的核黄素)。在化学合成核黄素的方法中，通常要经过多步骤并且必须使用价格较高的起始物质如D-核糖才能获得高纯度的产物。
使用微生物发酵生产维生素B2是化学合成核黄素的一种备选方法。这一方法的起始物质是可再生的原材料，如糖或植物油。用来产生核黄素的发酵用真菌已知的有如阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)或棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)(The Merck Index，Windholz等编辑，Merck& Co.，1183页，1983)，但是酵母如假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces)，或细菌如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状细菌属(Coryne bacteria)等也描述为核黄素的生产者。EP-A-0405370和EP-A-0821063描述了使用重组细菌菌株来进行核黄素的生产，该重组菌株是用核黄素生物合成基因转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)得到的。
WO 95/26406和WO 94/11515描述了如何将核黄素生物合成特异的基因从真核生物棉阿舒囊霉和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆的过程，还描述了已用这些基因转化的微生物以及此类微生物用于合成核黄素的用途。
WO 99/61623描述了核黄素生物合成基因(rib3、rib4、rib5)的选择是如何用来提高核黄素产量的。
在上述的生物中，从鸟苷三磷酸(GTP)和5-磷酸核酮糖开始共有6种酶催化核黄素的产生。其中，GTP环化水解酶-II(rib1基因产物)将GTP转化为2，5-二氨基-6-核糖基氨基-4-(3H)-嘧啶酮-5-磷酸。2，5-二氨基-6-核糖基氨基-4-(3H)-嘧啶酮-5-磷酸还原酶(rib7基因产物)接下来将2，5-二氨基-6-核糖基氨基-4-(3H)-嘧啶酮-5-磷酸还原生成2，5-二氨基-6-核糖基氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶酮-5-磷酸，随后2，5-二氨基-6-核糖基氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶酮-5-磷酸被特异的脱氨酶(rib2基因产物)脱去氨基生成5-氨基-6-核糖基氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶酮-5-磷酸。这种磷酸酯再被非特异的磷酸酶去磷酸化。
5-磷酸核酮糖是在核黄素生物合成最后的酶促步骤中除GTP以外的另一起始物质，5-磷酸核酮糖被3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合酶(rib3基因产物)转化为3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸(DBP)。
DBP和5-氨基-6-核糖基氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶酮都是酶促合成6，7-二甲基-8-核糖基-2，4-二氧四氢蝶啶的起始材料。这个反应由rib4基因产物(DMRL合酶)催化。DMRL接着被核黄素合酶(rib5基因产物)转化为核黄素(Bacher等(1993)，Bioorg.Chem.Front.3卷，SpringerVerlag)。
尽管在核黄素产生上已经取得了这些进展，仍然有必要改进和提高核黄素的生产率以适应需求的增长，并提升核黄素产生的效率。
本发明的一个目的是进一步提高维生素B2的生产率。通过微生物产生核黄素的方法，本发明人实现了这一目的，该方法通过培养一种能够产生核黄素的阿舒囊霉属的微生物，随后从培养基分离所产生的核黄素，所述阿舒囊霉属的微生物在选自rib1、rib2、rib4和rib7的至少两种基因的产物与野生型ATCC 10895相比显示出更高的活性。
这种提高核黄素产量的方法，优选地用能够合成核黄素并且其中具有例如以下rib基因产物的结合显示出活性提高的生物(数字在每一情况下均表示所讨论的rib基因产物)1+2，1+4，1+7，2+4，2+7，4+7。
特别优选的是这样的生物，其中以下rib基因产物的组合显示出活性的提高(数字在每一情况下均表示所讨论的rib基因产物)1+2+4，1+2+7，1+4+7，2+4+7。
对这些rib基因产物提高的活性进行了评估，这是通过与用作参考生物的棉阿舒囊霉菌株ATCC 10895相比较而实施的。测定rib基因产物活性亦即酶活性的相关方法为本领域技术人员所公知，并在文献中有所描述。
对于提高维生素B2的生产率，更为有益的方法是将自然酶活性的提高和上述基因组合的导入相结合来提高基因表达。
本发明方法的合适生物或宿主生物原则上可以是阿舒囊霉属中所有能够合成核黄素的生物。
术语rib基因产物不仅指序列表中SEQ ID NO2、4、6、8所描述的多肽序列，也指那些可以通过对这些序列进行氨基酸密码子的替换、插入或删除而获得的多肽序列，其中替换、插入或删除在氨基酸密码子中为不超过5％，优选地不超过3％，特别优选地不超过2％的多肽序列。例如自然等位基因的变异可以产生上述序列，它们也可通过对原始菌株进行诱变处理(例如诱变剂或者电磁辐射)并随后进行核黄素生产率提高的筛选来获得。
根据本发明rib1、rib2、rib4和rib7基因的结合和/或这些基因和它们的基因产物提高的活性使核黄素生产率显著提高。上述的基因原则上可以通过所有目前本领域技术人员公知的方法导入到生物中；有利地，用基因枪或显微注射等现有技术将这些基因转化、转染、电穿孔导入生物或它们的细胞中。就微生物来说，本领域技术人员可从下列教科书中找到合适的方法Sambrook J.等，(1989)分子克隆实验室手册，Cold SpringHarbor Laboratory Press；F.M.Ausubel等，(1994)现代分子生物学技术(Current protocols in molecular biology)，John Wiley and Sons；D.M.Glover等，DNA克隆(DNA Cloning)卷1，(1995)，IRL Press(ISBN019-963476-9)；Kaiser等(1994)酵母遗传学方法(Methods in YeastGenetics)，Cold Spring Harbor Laboratory Press或Guthrie等，酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法，1994，Academic Press。可以提到的有益方法的实例是例如在ura-3基因特别是阿舒囊霉属ura-3基因的协助下，通过同源或异源重组导入DNA，德国申请DE 19801120.2和/或下述的REMI法(＝“限制性酶介导的整合”)对此进行了描述。
REMI技术是以两端用相同限制性内切酶酶切的线性DNA构建体及用于限制性切割该DNA构建体的限制性内切酶的共转化为基础的。因此，该限制性内切酶剪切下述生物的基因组DNA，其中所述生物为已导入上述DNA构建体和限制性酶的生物。这导致同源修复机制被激活。这些修复机制修复基因组DNA上由内切酶造成的链断裂，与此同时，也会以一定的频率将共转化的DNA构建体掺入基因组。通常，DNA两端的限制性酶切位点得到保留。
Blker等在真菌的插入诱变中描述了这种技术(Mol Gen Genet，248，1995547-552)。为了阐明酵母中异源重组的存在，Schiestl和Petes(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，19917585-7589)使用过这种方法。Brown等(Mol.Gen.Genet.251，199675-80)描述了这种方法用于诱导型报告基因的稳定转化和可调节的表达。迄今为止，这种系统还没有作为优化代谢途径或蛋白的商业过量表达的遗传工程工具使用过。
有关核黄素的生物合成，已显示生物合成基因可以通过REMI法整合入上述生物的基因组中，并且可以优化初级和次级代谢所产生的代谢产物的产生过程，特别是生物合成途径，其中所述代谢产物例如氨基酸(如赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或色氨酸)、维生素(如维生素A、B2、B6、B12、C、D、E、F、S-腺苷甲硫氨酸、生物素、泛酸或叶酸)、类胡萝卜素(如β-胡萝卜素、菌脂色素(lycopin)、角黄素、虾青素或玉米黄质)、或蛋白质如水解酶(诸如脂肪酶、酯酶、酰胺酶、腈水解酶、蛋白酶)、介质如细胞因子，例如淋巴因子(如MIF、MAF、TNF)、白细胞介素如白细胞介素1、干扰素(如γ-干扰素)、tPA、激素(如蛋白激素、糖激素)、寡肽激素或多肽激素(如抗利尿激素、内啡肽、内皮抑素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)、生长因子促红细胞生成素、转录因子、整合蛋白(如GPIIb/IIIa或αvβ以及III)、受体(如多种谷氨酸受体)或血管发生因子如血管紧张素。
利用REMI法可将本发明的核酸片段或上述基因的核酸片段置于基因组中的转录活性位点。
将核酸与至少一个报告基因一起克隆至DNA构建体上是有益的，而此DNA构建体将导入基因组内。这种报告基因应当易于通过生长分析、荧光分析、化学发光分析、生物发光分析或通过光度测定进行检测。可提及的报告基因的实例有抗生素抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、葡萄糖苷酶基因、过氧化物酶基因或者生物合成基因(如核黄素基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、脂肪酶基因、酯酶基因、过氧化物酶基因、β-内酰胺酶基因、乙酰转移酶基因、磷酸转移酶基因或腺苷酰转移酶基因)。这些基因使得转录活性的检测和定量易于进行，因此对基因的表达检测和定量也易于进行。因此，在基因组上的定位即可得到确定，而其显示生产率的差异不超过2倍(见
图1)。图1显示通过整合得到的克隆LU21#1和LU21#2，以及它们不同的维生素B2(＝核黄素)生产率。
而如果生物合成基因本身易于检测，比如本申请中核黄素这样的情况，也可以不用额外的报告基因。
如果导入生物体内的基因不止一个，所有的这些基因可以与一个报告基因克隆入一个载体中共同导入生物体，每个基因也可以分别与一个报告基因克隆入分别的载体上，将这些分别的载体同时或依次导入生物体。编码所讨论活性的基因片段也可使用REMI技术进行操作。
原则上，所有已知的限制性酶都适用于本发明方法的将生物合成基因整合入生物基因组中。但是只识别4个碱基对酶切位点的限制性酶由于它们在欲整合的基因组或载体中剪切过频而不被优选；优选的是识别6、7、8或者更多碱基对作为酶切位点的限制性酶，比如BamHI、EcoRI、BglII、SphI、SpeI、XbaI、XhoI、NcoI、SalI、ClaI、KpnI、HindIII、SacI、PstI、BpnI、NotI、SrfI或SfiI，以及其它未提到的可能的限制性酶。当所用限制性酶在欲导入的DNA上不再有酶切位点是有利的，这样可提高整合效率。通常在REMI混合物中，限制性酶用量为5-500U，优选10-250U，特别优选10-100U。限制性酶有利地用于包含渗透稳定物质的水溶液中，其中所述渗透稳定物质如糖类(诸如蔗糖、海藻糖或葡萄糖)、多羟基化合物(如甘油或聚乙二醇)，具有有利缓冲范围pH5-9的缓冲剂，优选缓冲范围pH6-8，特别优选pH7-8，其中所述缓冲剂如Tris，MOPS，HEPES，MES或PIPES和/或稳定核酸的物质，如Mg、Cu、Co、Fe、Mn或Mo的无机盐或有机盐。根据需要，还可存在其它物质如EDTA、EDDA、DTT、β-巯基乙醇或核酸酶抑制剂。但是，REMI技术也可以在没有这些添加物时进行。
本发明的方法在5-80℃的温度范围内进行，优选10-60℃，特别优选20-40℃。所有已知的使细胞膜不稳定的方法都适用于本发明的方法，例如电穿孔、与运载囊泡融合或者用多种碱金属盐或碱土金属盐如锂盐、铷盐或钙盐去稳定，其中优选锂盐。
核酸在分离后可以直接用于或纯化后用于本发明的反应。
原则上，可用本领域技术人员公知的所有方法将rib基因的本发明提及的组合导入植物。
将外源基因转移入植物基因组称作转化。在本申请中，所描述的转化和从植物组织或植物细胞再生植物的方法可用于进行瞬时或稳定的转化。合适的方法有通过聚乙二醇诱导DNA摄入的原生质体转化、使用基因枪、电穿孔、在含DNA的溶液中干燥胚的培养、显微注射以及农杆菌介导的基因转移。上述方法在例如B.Jenes等，基因转移技术(Techniques forGene Transfer)，见转基因植物，卷1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press(1993)128-143以及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225中有描述。优选地，将待表达的构建体克隆入适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，如pBin19(Bevan等，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。用根癌农杆菌转化植物在例如Hfgen和Willmitzer，Nucl.Acid Res.(1988)16，9877一文中有描述。
根据本发明，携带表达载体的农杆菌也可通过已知的方法，例如通过将切割的叶及叶片浸入农杆菌溶液中，随后在合适的培养基中培养来转化植物，特别是作物植物，如谷物、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、芸苔、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、西红柿、油菜、紫花苜蓿、莴苣、多种树木、坚果、葡萄树以及豆类。
经遗传修饰的植物细胞可通过所有本领域技术人员公知的方法进行再生。合适的方法在上述S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Hfgen和Willmitzer发表的论文中找到。
有很多可能性可以提高细胞中rib基因产物的酶活性。
一种可能性是通过某种方法修饰内源的rib1、2、4、7基因以至于它们编码的酶的1、2、4或7的活性表现出比起始酶更高的活性。通过例如催化中心的改变来提高底物的转化，或者通过中和酶抑制剂的作用，可以对酶活性产生不同方面的提高，亦即它们的特异活性被提高或者它们的活性没有被抑制。在一个更为有利的实施例中，酶活性的提高也可能通过细胞中酶合成的提高来实现，例如通过去除抑制酶合成的因子，或者提高促进酶合成的因子或调节元件的活性，或者优选地，通过导入更多的基因拷贝。这些措施提高细胞中基因产物的整体活性而不改变其特异活性。这些方法也可以结合使用，亦即特异活性和整体活性都得以提高。基本上，可通过本领域技术人员公知的方法对这些基因、调控元件或其启动子的核酸序列进行修饰。为此目的，序列可以进行例如诱变，比如进行定点诱变，D.M.Glover等，DNA Cloning，卷1，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963476-9)，第6章，193页对此有描述。
Spee等(Nucleic Acids Research，21卷，3期，1993777-778)描述了利用dITP进行随机诱变的PCR法。
Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91卷，199410747-10751)描述了利用体外重组技术进行分子进化的研究。
Moore等(Nature Biotechnology，14卷，1996458-467)描述了PCR方法和重组方法的结合。
修饰后的核酸序列随后通过载体返回生物体内。
为了提高酶活性，也可将修饰后的启动子区置于天然基因的上游以提高基因的表达水平，并且因此提高酶活性。也可在3′端导入例如提高mRNA稳定性从而提高翻译水平的序列。这也可以带来酶活性的提高。
优选地，将额外的rib1、2、7和4基因拷贝联合导入细胞内。对这些基因拷贝可以进行天然调节，可以进行在天然调节区被修饰以至于它们可提高基因表达的经修饰调节，或可采用异源基因或实际为不同物种基因的调节序列。
将上述方法结合起来尤其有利。
在本发明方法中，将序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7或者它们的功能等同物进行结合是有利的。
为了实现异源基因在生物中的最佳表达，按照生物特定的密码子使用对核酸序列进行修饰是有利的。密码子使用易于通过计算机对所讨论生物的其他已知基因进行计算评估来确定。
增加rib1、2、7和4的基因拷贝数和/或增强rib1、2、7、4基因表达的正调节因子都将有利地提高rib1、2、7、4基因的表达。因此，通过使用强转录信号如启动子和增强子在转录水平上提高调节元件是优选的。但是除此之外，例如通过提高rib1、2、7、4 mRNA的稳定性或通过提高核糖体上此mRNA的读码效率，也可能实现翻译水平的提高。
为了提高基因拷贝数，例如可将rib基因1、2、7、4或同源基因掺入核酸片段或载体，其中所述核酸片段或载体优选包含rib基因的调节基因序列或者具有类似效果的启动子活性。
所使用的调节序列尤其为那些提高基因表达的序列。但是，备选地，可将每个上述基因导入独立载体并转化到所讨论的生产用生物中。
本发明的核酸片段理解为可操作地与一个或多个调节信号连接的rib基因序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7或者它们的功能等同物，其中所述调节信号优选可提高基因表达的调节信号。这些调节序列是，例如与诱导子或阻遏子结合的序列，因此可以调节核酸的表达。除了这些新的调节序列外，或者说并非这些序列，还有这些序列的天然调节仍可存在于实际的结构基因的上游，并且根据需要，可对它们进行遗传修饰，从而去除天然调节，提高基因表达。但是，基因构建体也可在结构上更简单，也就是说没有额外的调节信号被插入到SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7或它们的功能等同物的序列上游，并且天然的启动子及它的调节并没有被去除。取而代之的是，天然调节序列被突变，从而使得调节不再发生并提高基因表达。这些修饰过的启动子也可插入到它们自己的天然基因上游以提高活性。此外，基因构建体可以有利地包含一个或多个与启动子可操作地连接的已知增强子序列，这样有可能会提高核酸序列的表达。额外的有利序列如其它调节元件或终止子可以插入DNA序列的3’端。一个或多个rib基因拷贝可以出现在基因构建体中。
用于本发明方法的有利调节序列的例子为例如启动子cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子，这些序列在革兰氏阴性细菌中有利地使用。而更为有利的调节序列为例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2，酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH，或植物启动子CaMV 35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos，或者在泛素或菜豆球蛋白启动子上。本申请中，例如来自汉森酵母属中的丙酮酸脱羧酶和甲醇氧化酶启动子也是有利的。而更为有利的植物启动子有例如苯磺酰氨诱导的启动子(EP 388186)、四环素诱导的启动子(Gatz等，(1992)Plant J.2，397-404))、脱落酸诱导的启动子(EP 335528)或是乙醇或环己酮诱导的启动子(WO 9321334)。那些确保在嘌呤或其前体生物合成发生部位的组织或植物部分中表达的植物启动子尤其有利。确保叶特异性表达的启动子必须特别提及。特别提及马铃薯胞质FBPase启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445 245)。甘氨酸max磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子(也见Genbank登录号U87999)或另一个在EP 249676中提到的结节特异启动子也可有利地得到利用。
基本上，所有的天然启动子和其调节序列，例如上面提到的那些，都可以用于本发明的方法。除此之外，合成的启动子也可有利地得到利用。
导入生物内的其它基因可以像上述描述的那样额外地置于核酸片段上(＝基因构建体)。这些基因可以受到独立的调节或置于与rib基因相同的调节区下。这些基因可以是例如可能提高合成的其它生物合成基因。
对于在上述宿主生物中的表达，核酸片段有利地插入可使宿主菌中的基因表达优化的载体上，例如质粒、噬菌体或其他DNA。合适质粒的实例有，例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽胞杆菌中的pUB110、pC194或pBD214，棒状杆菌中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，酵母中的2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51，或是上述质粒的衍生物。上述提到的质粒只构成可供选择的较少的质粒。其它质粒为本领域技术人员所公知，并且可在例如克隆载体(Cloning Vectors)(Pouwels P.H等编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)一书中找到。合适的植物载体尤其在“植物分子生物学及生物技术方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)”(CRC Press)6/7章，71-119页中得以描述。
为了表达其它存在的基因，该核酸片段另外优选还包括用于提高表达的3’-和/或5’-末端调节序列，对该序列进行选择以优化被选中的宿主生物和基因与表达的关系。
这些调节序列用于使得有控制的基因和蛋白质表达成为可能。这意味着，取决于宿主生物，例如，基因仅在诱导后表达和/或过表达，或是立即表达和/或过表达。
本申请中，调节序列或因子可以优选具有正向调节效果，并且因此提高导入基因的基因表达。因而，优选地，通过使用强转录信号如启动子和/或增强子在转录水平来实现调节元件的增强。但是，除此之外，翻译的增强也可能通过例如提高mRNA的稳定性来实现。
在载体的另一个实施方案中，本发明的基因构建体有利地以线性DNA的形式导入微生物体内并且通过异源或同源重组整合入宿主生物的基因组。这个线性DNA可由线性化的质粒或者仅仅由作为载体的核酸片段组成。
任何能在细胞中自主复制的质粒(但是特别是携带酿酒酵母2μm质粒复制起点的质粒)，都同样可以用作载体，但是同样如前所述，可整合到宿主染色体内的线性DNA片段也是可以用作载体的。这种整合可以通过异源或同源重组实现，但是优选如所提及的那样通过同源重组整合(Steiner等，Genetics，140卷，1995973-987)。本申请中，基因rib1、rib2、rib4和rib7可以分别存在于基因组的不同位置或存在于不同的载体上或可以共同地位于基因组或一个载体上。
用于本发明方法中的包含rib基因1、2、7和4或它们的功能等同物的组合的生物显示出核黄素产量的提高。
在本发明方法中，用于产生核黄素的生物培养在允许其生长的培养基中。这些培养基可以是合成的培养基或天然的培养基。可使用并选择适合该生物生长的本领域技术人员公知的培养基。所用培养基包含碳源、氮源、无机盐和根据需要包含少量维生素及微量元素以支持微生物生长。
有利的碳源实例为糖(如单糖、二糖或多糖(如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素)、复合糖源(如糖蜜)、糖磷酸盐(如1，6-二磷酸果糖)、糖醇(如甘露醇)、多羟基化合物(如甘油)、醇类(如甲醇或乙醇)、羧酸(如柠檬酸、乳酸或乙酸)、脂肪(大豆油或油菜油)、氨基酸如氨基酸混合物(如水解酪蛋白氨基酸)或单个氨基酸(如甘氨酸或天冬氨酸)或者氨基糖，后面提及的这些也可以同时作为氮源。
有利的氮源为有机或者无机含氮化合物或包含这些化合物的材料。实例有铵盐如NH4Cl或(NH4)2SO4、硝酸盐、尿素，或者复合氮源，如玉米浆、啤酒酵母自溶物、大豆粉、面筋、酵母提取物、肉膏、酪蛋白水解物、酵母或马铃薯蛋白，所有这些都可以经常同时作为氮源。
无机盐的实例有钙盐、镁盐、钠盐、钴盐、钼盐、锰盐、钾盐、锌盐、铜盐和铁盐。而作为这些盐的阴离子，氯化物、硫酸盐、磷酸盐应当特别提及。本发明方法中提高生产率的一个重要因素是对生产培养基中Fe2+或Fe3+离子浓度的控制。
根据需要，营养培养基中应再补充一些生长因子如维生素或生长促进剂(如生物素、核黄素、维生素B1、叶酸、烟酸、泛酸盐或维生素B6、氨基酸(如丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸或缬氨酸)、羧酸(如柠檬酸、蚁酸、庚二酸或乳酸)，或如二硫苏糖醇这样的物质。
上述营养物质的混合比例根据发酵类型不同而定，并且要根据个案来调整。所有的培养基成分可在发酵开始时准备好，此前根据需要进行单独或共同灭菌，也可以根据需要在发酵过程中连续加入或分批加入。
生长条件设定为使得所述生物的生长良好，从而尽量获得最高的产量。优选的生长温度是15-40℃，特别优选25-37℃。pH值范围优选3-9，特别优选5-8。通常，培养时间可以从若干小时到若干天，优选8小时到21天，特别优选4小时到14天，所述生长时间通常是足够的。在此时期，培养基中的产物可以最大程度地积累。
本领域技术人员可以从例如下列教科书中找到培养基的优化应用微生物生理学，“实用方法”(Applied Microbial Physiology，“A PracticalApproach”)(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury编辑，IRL Press，1997，53-73页，ISBN 0 19 963577 3)。而有益于芽孢杆菌和其他生物的培养基和生长条件可在专利EP A 0405370的公开文本特别是其实施例9中获知，适用于假丝酵母生长的培养基和生长条件可在专利WO 88/09822的公开文本特别是其表3中获知，适用于阿舒囊霉属生长的培养基和生长条件可在Schmidt等(Microbiology，142，1996419-426)发表的论文中获知。
本发明的方法可以连续地或不连续地以分批培养或补料分批培养实施。
取决于所用生物初始的生产率，通过本发明的方法核黄素生产率能够得到或多或少的提高。一般来说生产率会比原始菌株有利地提高至少5％，优选至少10％，特别优选20％，尤其特别优选较原始菌株生产率至少提高100％。
实施例从棉阿舒囊霉和酿酒酵母中分离rib基因1，2，3，4，5和7在专利WO 95/26406和WO 93/03183且尤其是在实施例中有所描述，并且其操作相似。这些公开文本在此处特别提及。
序列1显示了包含转化所需的选择性标记之外还携带有rib1、rib2、rib4和rib7基因片段的DNA构建体。
常规方法例如克隆、限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的连接、微生物转化、细菌培养和重组DNA的序列分析，这些方法除非特别指出，都可以参照Sambrook等(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory PressISBN 0-87969-309-6)描述的方法实施。
重组DNA分子按照Sanger法(Sanger等，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)采用ABI激光荧光DNA测序仪测序。聚合酶链反应的片段被测序并进行修正以避免待表达的构建体中聚合酶导致的错误。
实施例1包含rib1，rib2，rib4和rib7基因拷贝的DNA构建体的克隆(载体Tef-G418-Tef rib1，2，7，4)。
rib基因的表达构建体载体TefG418Tefrib3，4，5在WO 99/61623中描述。该载体用KpnI酶切，沉淀，重新溶解并随后用NheI部分消化。将用NheI和KpnI酶切一次的较大片段从琼脂糖凝胶中分离出来。rib7基因从pJR765载体中(在WO 95/26406中描述)用PCR(引物TCGAGGTACCGGGCCCCCCCTCGA；TCGAACTAGTAGACCAGTCAT)克隆出来。该特异性PCR产物用KpnI/SpeI酶切并且与上述KpnI/NheI酶切载体连接。由此产生TefG418Tefrib7，4载体。
rib2基因从载体pJR758(WO 95/26406)通过PCR扩增，并且产物用SpeI和NheI酶切(引物CCCAACTAGTCTGCAGGACAATTTAAA；AGTGCTAGCCTACAATTCGCAGCAAAAT)。该DNA片段与NheI酶切并经磷酸酶处理过的载体TefG418Tefrib7，4连接。由此产生TefG418Tefrib7，4，2.载体。
Rib1基因通过PCR从载体pJR765(WO 95/26406)扩增(引物GTAGTCTAGAACTAGCTCGAAACGTG；GATTCTAGAACTAGAACTAGTGGATCCG)并且用XbaI酶切。该DNA片段与NheI酶切并经磷酸酶处理过的载体TefG418Tefrib7，4，2连接。
获得的DNA构建体构成了Tef-G418-rib1，2，7，4载体。
实施例2将DNA构建体转化入真菌棉阿舒囊霉。
用限制性酶XbaI彻底酶切实施例1中所述DNA构建体(载体Tef-G418-rib1，2，4，7)，携带rib基因序列的插入片段通过琼脂糖凝胶分离进行纯化。
将MA2培养基(10g/l细菌用蛋白胨，1g/l酵母提取物、0.3g/l肌醇以及10g/l D-葡萄糖)与阿舒囊霉孢子一起培养。培养物于4℃下培养12小时，随后于28℃下摇晃培养13小时。细胞悬液离心沉淀，细胞沉淀以5ml pH7.5的50mM磷酸钾缓冲液(含25mM DTT)重悬。在28℃下热处理30分钟后，细胞再次离心沉淀，于25ml STM缓冲液(270mM蔗糖，10mM TRIS-HCl pH7.5，1mM MgCl2)重悬。0.5ml的这种悬液用大约3μg的上述纯化插入片段和40U SpeI酶处理，并用Biorad基因脉冲发生器进行电穿孔(100Ω，20μF，1.5kV)。电穿孔后，这些细胞用1ml的MA2培养基处理并且涂布到MA2琼脂培养平板上。为了使用抗生素筛选，这些平板在28℃下培养5小时后用一层包含抗生素G418(200μg/ml)的5ml低熔点琼脂糖覆盖。转化株通过显微操作技术进行克隆纯化(Steiner和Philipsen(1995)Genetics，140；973-987)。
通过对转化体基因DNA进行PCR分析来证实构建体的成功整合。基因组DNA通过Carle和Olson(Proc.Natl.Acad.Sci，1985，82，3756-3760)以及Wright和Philipsen(Gene，1991，109，99-105)所述的方法进行分离。PCR用R.Saiki(PCR方法，1990，Academic Press，13-20)的方法以构建体特异的引物进行。PCR片段的分析通过在琼脂糖凝胶中分离进行。
对所有的转化株来说，对基因组的成功整合都可通过PCR方法验证。
实施例3重组棉阿舒囊霉克隆中核黄素的测定将棉阿舒囊霉LU21(野生型菌株，ATCC 10895)和实施例1中所述构建体经转化得到的菌株LU21#1和#2在琼脂培养基上于28℃培养4天。用3个包含10ml培养基(27.5g/l酵母提取物，0.5g/l硫酸镁，50ml/l豆油，pH7.0)的100ml三角瓶从此平板上接种培养。在摇床上以28℃和180转/分培养40小时后，将1ml培养液转移至包含20mlYPD培养基(10g/l酵母提取物，20g/l细菌用蛋白胨，20g/l葡萄糖)的250ml三角瓶中。在28℃和300转/分下培养。190小时后，从每个瓶子中取1ml样品，并用1ml的1M高氯酸处理。样品经过滤，用HPLC分析测定核黄素含量。以核黄素标准品(10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l)校准。
测定核黄素所用HPLC法的参数柱 ODS Hypersil 5mm 200×2.1mm(HP)洗脱液A将340ml H3PO4(89％)加至水中至pH2.3洗脱液B100％乙腈梯度停留时间 0-6分钟.2％B-50％B6-6.5分钟50％B-2％B流速 0.5ml/分钟检测 280nm温度 40℃进样 2-10ml与起始菌株比较，包含有额外rib基因1，2，4和7拷贝的克隆#1和#2批次显示核黄素生产率得到显著提高(图1)。
图1显示不同克隆的核黄素产量。与未修饰的菌株比较，通过导入rib1、2、4和7基因，核黄素产量可提高到135％。
序 列 表<110>巴斯福股份公司<120>用于提高核黄素产量的遗传菌株的优化<130>NAE 176/01<140>
<141>
<160>8<170>PatentIn版本2.0<210>1<211>1052<212>DNA<213>棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)<220>
<221>CDS<222>(137)..(1042)<400>1aaaggctttt ccgtaggtgc tttgtcattc aacaatccac gtcggaattg gcgactatat 60agtgtagggc ccataaagca gtagtcggtg ttgatagctg tgtcagacca actctttgtt 120aattactgaa gctgat atg act gaa tac aca gtg cca gaa gtg acc tgt gtc 172Met Thr Glu Tyr Thr Val Pro Glu Val Thr Cys Val1 5 10gca cgc gcg cgc ata ccg acg gta cag ggc acc gat gtc ttc ctc cat 220Ala Arg Ala Arg Ile Pro Thr Val Gln Gly Thr Asp Val Phe Leu His15 20 25cta tac cac aac tcg atc gac agc aag gaa cac cta gcg att gtc ttc 268Leu Tyr His Asn Ser Ile Asp Ser Lys Glu His Leu Ala Ile Val Phe30 35 40ggc gag aac ata cgc tcg cgg agt ctg ttc cgg tac cgg aaa gac gac 316Gly Glu Asn Ile Arg Ser Arg Ser Leu Phe Arg Tyr Arg Lys Asp Asp
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<212>DNA<213>棉阿舒囊霉<220>
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<221>CDS<222>(195)..(713)<400>5ttgagctata tgtaagtcta ttaattgatt actaatagca atttatggta tcctctgttc 60tgcatatcga cggttactca cgtgatgatc agcttgaggc ttcgcggata aagttccatc 120
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160 165 170tga atattaaaaa atcacta 730<210>6<211>172<212>PRT<213>棉阿舒囊霉<400>6Met Ile Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Thr Tyr Asp Ala Ser Ser1 5 10 15Val Lys Val Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Val Ile Asp20 25 30Ala Leu Val Gln Gly Ala Ile Glu Lys Leu Leu Ala Met Gly Val Lys35 40 45Glu Lys Asn Ile Thr Val Ser Thr Val Pro Gly Ala Phe 6lu Leu Pro50 55 60Phe Gly Thr Gln Arg Phe Ala Glu Leu Thr Lys Ala Ser Gly Lys His65 70 75 80Leu Asp Val Val Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Asp Ser Met85 90 95His Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ser Val Thr His Ala Leu Met Asn Leu100 105 110Gln Lys Lys Ile Arg Leu Pro Val Ile Phe Gly Leu Leu Thr Cys Leu115 120 125Thr Glu Glu Gln Ala Leu Thr Arg Ala Gly Leu Gly Glu Ser Glu Gly130 135 140Lys His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala145 150 155 160Val Lys Phe Gly Pro Arg Ala Glu Gln Met Lys Lys165 170
<210>7<211>1109<212>DNA<213>棉阿舒囊霉<220>
<221>CDS<222>(352)..(1092)<400>7gaagaagcgc aggcgccagt ccgagctgga ggagaacgag gcggcgcggt tgacgaacag 60cgcgctgccc atggacgatg cgggtataca gacggcgggt atacagacgg cgggtggtgc 120cgagagaggc accaggccgg cttcctccag cgatgcaagg aagagaaggg gaccagaggc 180gaagttcaag ccatctaagg tacagaagcc ccaattgaag cgaactgcat cgtcccgggc 240ggatgagaac gagttctcga tattatagag gcccccgttt cgagtgattg gcgtcaaaaa 300cggctatctg ccttcgtccg cccccaccac cctcgggaac actggcaaac c atg gcg 357Met Ala1cta ata cca ctt tct caa gat ctg gct gat ata cta gca ccg tac tta 405Leu Ile Pro Leu Ser Gln Asp Leu Ala Asp Ile Leu Ala Pro Tyr Leu5 10 15ccg aca cca ccg gac tca tcc gca cgc ctg ccg ttt gtc acg ctg acg 453Pro Thr Pro Pro Asp Ser Ser Ala Arg Leu Pro Phe Val Thr Leu Thr20 25 30tat gcg cag tcc cta gat gct cgt atc gcg aag caa aag ggt gaa agg 501Tyr Ala Gln Ser Leu Asp Ala Arg Ile Ala Lys Gln Lys Gly Glu Arg35 40 45 50acg gtt att tcg cat gag gag acc aag aca atg acg cat tat cta cgc 549Thr Val Ile Ser His Glu Glu Thr Lys Thr Met Thr His Tyr Leu Arg55 60 65tac cat cat agc ggc atc ctg att ggc tcg ggc aca gcc ctt gcg gac 597Tyr His His Ser Gly Ile Leu Ile Gly Ser Gly Thr Ala Leu Ala Asp
70 75 80gac ccg gat ctc aat tgc cgg tgg aca cct gca gcg gac ggg gcg gat 645Asp Pro Asp Leu Asn Cys Arg Trp Thr Pro Ala Ala Asp Gly Ala Asp85 90 95tgc acc gaa cag tct tca cca cga ccc att atc ttg gat gtt cgg ggc 693Cys Thr Glu Gln Ser Ser Pro Arg Pro Ile Ile Leu Asp Val Arg Gly100 105 110aga tgg aga tac cgc ggg tcc aaa ata gag tat ctg cat aac ctt ggc 741Arg Trp Arg Tyr Arg Gly Ser Lys Ile Glu Tyr Leu His Asn Leu Gly115 120 125 130aag ggg aag gcg ccc ata gtg gtc acg ggg ggt gag ccg gag gtc cgc 789Lys Gly Lys Ala Pro Ile Val Val Thr Gly Gly Glu Pro Glu Val Arg135 140 145gaa cta ggc gtc agt tac ctg cag ctg ggt gtc gac gag ggt ggc cgc 837Glu Leu Gly Val Ser Tyr Leu Gln Leu Gly Val Asp Glu Gly Gly Arg150 155 160ttg aat tgg ggc gag ttg ttt gag cga ctc tat tct gag cac cac ctg 885Leu Asn Trp Gly Glu Leu Phe Glu Arg Leu Tyr Ser Glu His His Leu165 170 175gaa agt gtc atg gtc gaa ggc ggc gcg gag gtg ctc aac cag ctg ctg 933Glu Ser Val Met Val Glu Gly Gly Ala Glu Val Leu Asn Gln Leu Leu180 185 190ctg cgc cca gat att gtg gac agt ctg gtg atc acg ata gga tcc aag 981Leu Arg Pro Asp Ile Val Asp Ser Leu Val Ile Thr Ile Gly Ser Lys195 200 205 210ttc ctg ggc tca cta ggt gtt gcg gtc tca cca gct gag gag gtg aac 1029Phe Leu Gly Ser Leu Gly Val Ala Val Ser Pro Ala Glu Glu Val Asn215 220 225cta gag cat gtg aac tgg tgg cac gga aca agt gac agt gtt ttg tgc 1077Leu Glu His Val Asn Trp Trp His Gly Thr Ser Asp Ser Val Leu Cys230 235 240ggc cgg ctc gca tag cggttatgac tggtcta1109Gly Arg Leu Ala
245<210>8<211>246<212>PRT<213>棉阿舒囊霉<400>8Met Ala Leu Ile Pro Leu Ser Gln Asp Leu Ala Asp Ile Leu Ala Pro1 5 10 15Tyr Leu Pro Thr Pro Pro Asp Ser Ser Ala Arg Leu Pro Phe Val Thr20 25 30Leu Thr Tyr Ala Gln Ser Leu Asp Ala Arg Ile Ala Lys Gln Lys Gly35 40 45Glu Arg Thr Val Ile Ser His Glu Glu Thr Lys Thr Met Thr His Tyr50 55 60Leu Arg Tyr His His Ser Gly Ile Leu Ile Gly Ser Gly Thr Ala Leu65 70 75 80Ala Asp Asp Pro Asp Leu Asn Cys Arg Trp Thr Pro Ala Ala Asp Gly85 90 95Ala Asp Cys Thr Glu Gln Ser Ser Pro Arg Pro Ile Ile Leu Asp Val100 105 110Arg Gly Arg Trp Arg Tyr Arg Gly Ser Lys Ile Glu Tyr Leu His Asn115 120 125Leu Gly Lys Gly Lys Ala Pro Ile Val Val Thr Gly Gly Glu Pro Glu130 135 140Val Arg Glu Leu Gly Val Ser Tyr Leu Gln Leu Gly Val Asp Glu Gly145 150 155 160Gly Arg Leu Asn Trp Gly Glu Leu Phe Glu Arg Leu Tyr Ser Glu His165 170 175His Leu Glu Ser Val Met Val Glu Gly Gly Ala Glu Val Leu Asn Gln180 185 190
Leu Leu Leu Arg Pro Asp Ile Val Asp Ser Leu Val Ile Thr Ile Gly195 200 205Ser Lys Phe Leu Gly Ser Leu Gly Val Ala Val Ser Pro Ala Glu Glu210 215 220Val Asn Leu Glu His Val Asn Trp Trp His Gly Thr Ser Asp Ser Val225 230 235 240Leu Cys Gly Arg Leu Ala24权利要求
1.用于微生物产生核黄素的方法，所述方法通过培养能够产生核黄素且在选自rib1、rib2、rib4和rib7的至少两种基因产物与野生型ATCC 10895相比显示出更高活性的阿舒囊霉属(Ashbya)微生物，随后从培养基分离所产生的核黄素。
2.如权利要求1所述的方法，其中选自rib1、rib2、rib4和rib7的三种基因产物显示出更高的活性。
3.如权利要求1所述的方法，其中选自rib1、rib2、rib4和rib7的四种基因产物显示出更高的活性。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中rib基因产物的较高基因活性是由基因表达的提高所引起。
5.如权利要求4所述的方法， 其中所述基因表达的提高是由基因拷贝数的增加所引起。
6.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中rib基因产物具有如SEQ ID NO2、4、6、8所示的多肽序列，或由这些序列通过替换、插入或删除至多5％氨基酸密码子而获得的多肽序列。
全文摘要
用于微生物产生核黄素的方法，所述方法通过培养能够产生核黄素且在选自rib1、rib2、rib4和rib7的至少两种基因产物与野生型ATCC 10895相比显示出更高活性的阿舒囊霉属微生物，随后从培养基分离所产生的核黄素。
文档编号C12N15/80GK1599796SQ02824270
公开日2005年3月23日 申请日期2002年12月3日 优先权日2001年12月4日
发明者H·阿尔特费赫, J·L·雷韦尔塔, 多瓦尔 申请人:巴斯福股份公司