专利名称：生产核黄素的微生物和利用其生产核黄素的方法
技术领域：
本发明涉及生产核黄素的微生物和利用其生产核黄素的方法。更具体地，本发明涉及与亲株相比具有增强的核黄素生产力的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的突变株，和利用其生产核黄素的方法。
背景技术：
核黄素，也已知为维生素B2，是一种水溶性维生素，其通过各种微生物和植物的生物合成来制备。然而，在脊椎动物包括人中却不能生物合成核黄素。核黄素是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)、在所有细胞体的氧化-还原反应中涉及的辅酶的前体，因此是动物包括人必需的养分。核黄素缺乏可导致嘴和咽粘膜发炎，皮肤炎症和其它皮肤损伤，结膜炎，弱视，生长抑制和重量减轻。因此，核黄素用作预防或治疗与前述维生素缺乏有关的疾病的维生素产品，或作为饲养家畜的饲料添加剂。特别是，浓缩的核黄素本身已被用作饲料。目前核黄素的世界产量是每年3,000吨，其中75％用于饲料添加剂，其余的用于食品和药品。
目前，通过化学合成或通过发酵微生物来生产核黄素。在化学合成中，利用一种前体如D-核糖，用多步法来生产高纯度的核黄素。然而，由于起始物质的成本高，所以化学合成的生产成本也是高的。因此，已开发出了利用微生物的核黄素发酵方法。适于发酵方法的微生物可以是任何存在于自然界的产生核黄素的微生物或通过遗传工程、化学或物理方法转化的过量生产核黄素的微生物。将这些微生物在适当的条件下培养，以生产核黄素。从培养物中重新获得生产的核黄素。
广为人知的适于生产核黄素的微生物是属于酵母种群的酿酒酵母和假丝酵母，属于细菌种群的梭菌，杆菌和棒杆菌，和属于真菌种群的假囊酵母和Ashbya sp.。
美国专利No.5,231,007公开了一种利用假丝酵母生产核黄素的方法。它报道了过量表达在核黄素生物合成过程中涉及的酶的基因的遗传工程修饰的枯草芽孢杆菌和产氨棒杆菌分别产生4.5g/l和17.4g/l的核黄素[Perkins等.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，228-18，1999]。欧洲专利No.EP 0 821 063公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌生产核黄素的方法。美国专利No.5,837,528公开了一种过量生产核黄素的枯草芽孢杆菌的重组菌株，其通过利用重组技术，将rib操纵子引入到亲株中而获得。另外，还有Windholz等[The Merk Index，Merk & Co.，1183页，1983]报道的阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)和棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii)子囊真菌作为生产核黄素的微生物。特别是，报道了在含糖蜜或植物油作为主要碳源的营养培养基中，这些子囊真菌突变株的培养物每一升发酵溶液产生15g的核黄素[Bigelis，生物技术，7b卷，243页，1989]。WO95/26406中也公开了利用棉病阿舒囊霉来生产核黄素。
然而，仍然需要开发具有增强的核黄素生产力的微生物来大量生产核黄素。
其间，在利用微生物的发酵方法中，开发了具有渗透压抗性的微生物菌株，以获得高浓度的培养物产品和高产率。具有渗透压抗性的微生物菌株能以高产率生产培养物产品是由于它的生长和代谢不被由过量的碳源和培养物产品的积累导致的外部渗透压的增加所抑制。在前述的基础上，本发明人开发了高浓度和高产率生产5’-肌苷酸的微生物菌株，该菌株是通过开发一种对脯氨酸类似物具有抗性，以增强它的脯氨酸生物合成的能力，从而增强微生物的渗透压抗性特征的微生物菌株而获得，其公开于韩国专利No.330712。
发明内容
本发明提供了抗脯氨酸类似物的生产核黄素的枯草芽孢杆菌。
本发明还提供了一种利用枯草芽孢杆菌生产核黄素的方法。
依照本发明的一个方面，提供了抗脯氨酸类似物、生产核黄素的枯草芽孢杆菌。优选使用枯草芽孢杆菌CJKB0001(保藏号KCCM-10445)。
在寻找具有增强的核黄素生产力的微生物的过程中，本发明人发现，在枯草芽孢杆菌上诱导突变并对其引入脯氨酸类似物抗性，导致渗透压抗性和核黄素生产力的增强。在这些菌株中，本发明人选择了过量生产核黄素并且高产率的菌株，并利用所选择的菌株大规模生产核黄素。
依照本发明的另一个方面，提供了一种生产核黄素的方法，其包含培养这种枯草芽孢杆菌和从培养物中回收核黄素。
以下，将详细描述本发明。
本发明的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌AS5的突变株。由于它抗脯氨酸类似物，并且它提高了脯氨酸生物合成，导致了增强的渗透压抗性。因此，它以高产率生产高浓度的核黄素。
当菌体外部的渗透压增加时，大多数微生物通过积累钾离子和称为渗压剂的有机溶质来增加菌体内的渗透压，以防止渗透性脱水。渗压剂包括，但不局限于L-脯氨酸，谷氨酸，糖，和N-甲基化的氨基酸衍生物。在它们之中，已知L-脯氨酸是渗透压调节的关键因素。据报道，当谷氨酸棒杆菌(Brebvibacterium lactofermentum)外部的渗透压增加时，L-脯氨酸生物合成的关键酶吡咯啉-5-羧酸酯(carboxylate)还原酶的活性增加，从而导致菌体内L-脯氨酸的积累[Agr，Bio，chem.，53(9)2475-2479，1989]。另外，已报道了由菌体外部渗透压引起的大肠杆菌(Escherichiacoli)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)等的菌体内L-脯氨酸的积累[J.Bacteriol.，163296，1985]。
因此，本发明人在枯草芽孢杆菌AS5上诱导突变，以提供渗透压抗性，然后筛选具有脯氨酸类似物抗性的突变株，其可在含高浓度脯氨酸类似物的培养基中生长。在它们中间，选择出了具有最高核黄素生产力的一个突变株。
脯氨酸类似物包括，但不局限于，3，4-脱氢脯氨酸，L-铃兰氨酸，硫代脯氨酸，L-噻唑烷-4-羧酸，(S)-2，2-二甲基-4-oxazolidecarboxylic acid，(S)-5，5-二甲基-4-thiazolidecarboxylic aicd，(4S，2RS)-2-乙基-噻唑烷-4-羧酸，(2S，4S)-4-羟基-2-吡咯啉-羧酸，2-哌啶羧酸，和2，5-吡咯烷二酮。
此处使用的亲株是枯草芽孢杆菌AS5(BIONOM-S，莫斯科，俄罗斯)。
常规的物理或化学方法可在亲株上诱导突变。例如，可将亲株曝露于X-射线或紫外光，或化学试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)，硫酸二乙酯和乙胺中。
本发明人在包含各种浓度的、作为脯氨酸类似物的硫代脯氨酸的培养基中培养被诱导突变的菌株。筛选能在存在高浓度硫代脯氨酸的条件下生长的突变株。在它们中间，筛选到具有最高核黄素生产力的一个突变株。将筛选到的突变株命名为枯草芽孢杆菌CJKB0001，并于2002年11月18日保藏于韩国微生物培养中心(保藏号KCCM-10445)。
本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)可在包含甚至高达70mg/l硫代脯氨酸的培养基中生长。另一方面，作为亲株的枯草芽孢杆菌AS5在存在多于40mg/l的硫代脯氨酸的条件下就不能生长。
因此，与亲株相比，本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)具有脯氨酸类似物抗性，并且即使当高浓度的溶质在菌体外积累时，枯草芽孢杆菌CJKB0001也可通过在菌体内积累高浓度的脯氨酸来积累高浓度的核黄素，从而有效防止由渗透压引起的对它的生长和代谢的抑制。
另外，本发明人注意到，在瓶培养中，本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)积累8.0g/l核黄素，这比枯草芽孢杆菌AS5积累的核黄素高11％，并且在5升的发酵罐培养中，它们也积累26.8g/l核黄素，这比亲株积累的核黄素高19.6％。
因此，当与枯草芽孢杆菌AS5相比较时，本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)对脯氨酸类似物具有增强的抗性，并且由于具有渗透压抗性而具有显著增强的核黄素生产力。
为了生产核黄素，在合适的条件下培养本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)。
详细地，将枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)接种到含合适碳源、氮源和无机化合物的常规培养基中，并在有氧条件下，在预定的温度和pH下培养。碳源的实例包括葡萄糖，糖蜜，乳糖，蔗糖，麦芽糖，糊精，淀粉，甘露糖醇，山梨醇和甘油。优选葡萄糖和糖蜜。氮源的实例包括无机来源如氨，氯化铵，和硫酸铵，和有机来源如胨，NZ-胺，牛肉膏，酵母提取物，玉米浆，酪蛋白水解物，鱼或鱼粉，和脱脂豆饼或豆粉。优选酵母提取物和玉米浆。无机化合物的实例包括磷酸一氢钾，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸锰和碳酸钙。当需要时，可使用维生素和营养缺陷型基质(auxotrophic bases)。对于培养，可使用通过通气进行的振荡培养或搅拌培养。培养温度为30-45℃，优选37-40℃。在培养过程中，优选将pH调至相当中性的水平。培养期为5-6天。
依照本发明的一个实施方案，将枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)接种到接种培养基中，并在1vvm的通气流速、37℃和8,000rpm的条件下培养20小时。将接种培养物接种到发酵培养基中，并在1vvm的通气流速、40℃，800rpm和pH7.0的条件下，进行振荡培养60-70小时。在振荡培养过程中，对发酵培养物补充以葡萄糖补充培养基，以维持培养物中残余葡萄糖水平为0.5-1％，直至发酵培养物中葡萄糖总含量达到20％为止。当与亲株相比较时，产生了增加约19.6％水平的核黄素。
以下，通过实施例将更具体地描述本发明。然而，提供下述实施例仅是为了解释本发明，因此本发明不被它们所限制。
具体实施例方式
实施例1筛选本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001为了获得本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001，将作为亲株的枯草芽孢杆菌AS5进行突变。然后，在含硫代脯氨酸的培养基中培养枯草芽孢杆菌AS5的突变株，以获得集落。在这些集落中，筛选具有最高核黄素生产力的突变株，命名为枯草芽孢杆菌CJKB0001。
作为亲株的枯草芽孢杆菌AS5获自BIONOM-S，Ltd.(Obolensk，莫斯科，俄罗斯)。将枯草芽孢杆菌AS5悬浮于pH 7.0的磷酸盐缓冲液或pH5.5的柠檬酸盐缓冲液中，使得细胞密度为107-108细胞/ml。向混悬液中加入突变诱导剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，直至它的浓度为10-50μg/ml。在室温或30℃下孵育得到的混合物30-60分钟，以诱导突变。然后，用0.85％盐溶液洗涤混合物三次，并以适当的方式稀释。将稀释的溶液接种到具有各种浓度硫代脯氨酸的含1.8％琼脂的基本培养基中，并在37℃培养5天以获得集落。在这种情况下，硫代脯氨酸的浓度为0mg/l-100mg/l。将形成的集落接种到营养琼脂培养基中，并在37℃培养24小时。然后，将得到的营养培养物接种到发酵培养基中，并在37℃培养4-5天。筛选生产核黄素最高的菌株。每种培养基组分示于表1。
表1筛选本发明枯草芽孢杆菌CJKB0001的培养基组分
通过HPLC测量核黄素的生产力。利用与kromasil C18(5μm)柱(内径4.6mm，长250mm)偶联的waters 510来进行HPLC。5mM六磺酸钠和20mM H3PO4的混合溶剂和乙腈(89∶11，体积/体积)用作流动相。流动相的流速为1ml/min。样品的注射量为15μl，并使用蒸馏水稀释样品。另外，使用UV监测仪(TSP UV2000，UV260nm)作为监测仪。
依照试验结果，在含70mg/l硫代脯氨酸的培养基上生长的突变株显示杰出的核黄素生产力。在它们中间，筛选到一个具有最高核黄素生产力的突变株，并表示为枯草芽孢杆菌CJKB0001。枯草芽孢杆菌CJKB0001于2002年11月18日被保藏于韩国微生物培养中心，保藏号KCCM-10445。
实施例2评估枯草芽孢杆菌CJKB0001和枯草芽孢杆菌AS5对硫代脯氨酸的抗性在本实施例中，为了评估对硫代脯氨酸的抗性，将实施例1的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)和作为亲株枯草芽孢杆菌AS5在含各种浓度硫代脯氨酸的培养基中培养。详细地，将各个菌株接种到如表1所示的含硫代脯氨酸的培养基中，并在37℃培养5天。在这种情况下，硫代脯氨酸的浓度为0-100mg/l。
依照如表2所示的试验结果，在含多于40mg/l硫代脯氨酸的培养基中枯草芽孢杆菌AS5不能生长。另一方面，本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)甚至可在含70mg/l硫代脯氨酸的培养基中生长。
表2评估枯草芽孢杆菌CJKB0001和枯草芽孢杆菌AS5对硫代脯氨酸的抗性菌株硫代脯氨酸的浓度(mg/l)0 20 40 50 70 100枯草芽孢杆菌AS5 +++++ + - - -枯草芽孢杆菌++++++ +++++ + -CJKB0001(KCCM-10445)+生长，-不生长实施例3在瓶中本发明枯草芽孢杆菌CJKB0001的发酵潜能评估在瓶中枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)和枯草芽孢杆菌AS5的发酵潜能。将每个菌株接种到接种培养基中并培养。然后，将每个接种培养物转移到在瓶中的发酵培养基中。接种培养基如下制备在具有18mm直径的试验管中分配5ml的接种培养基，然后在121℃下压力灭菌试验管15分钟。将每个枯草芽孢杆菌CJKB0001和枯草芽孢杆菌AS5接种到接种培养基中，并在200rpm和37℃下振荡培养20小时。当完成接种培养时，将1ml每个接种培养物接种到瓶中的发酵培养基中，并在200rpm和37℃下振荡培养90小时。通过以与制备接种培养基相同的方式在压力灭菌培养基FA和培养基FS，并将15ml培养基FA和5ml培养基FS分配到250ml振荡培养瓶中来制备发酵培养基，所述培养瓶在压力下预先灭菌。当发酵完成时，以与实施例1相同的方式测量积累到发酵培养物中的核黄素的浓度。本实施例中使用的接种培养基和发酵培养基的每个组分示于表3。
表3适于在瓶中发酵的培养基的组分
依照试验结果，作为亲株的枯草芽孢杆菌AS5生产7.2g/l核黄素。另一方面，本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)生产8.0g/l核黄素，其比枯草芽孢杆菌AS5高11％。
实施例4在5升发酵罐中，本发明枯草芽孢杆菌CJKB0001的发酵潜能以比较的方式评估枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)和枯草芽孢杆菌AS5在5升发酵罐中的发酵潜能。将每个菌株接种到接种培养基中并培养。然后，将每个接种培养物接种到发酵培养基中，并补料分批培养。为了这样，首先，将1升每种接种培养基分发到2.5升的实验室发酵罐中，并在121℃下压力灭菌10分钟，以制备接种培养基。在接种培养基冷却后，将10ml的每种枯草芽孢杆菌CJKB0001和枯草芽孢杆菌AS5在盐溶液中的混悬液接种到接种培养物中。然后，将每种含菌株的接种培养物在1vvm速率的无菌通风、37℃和8000rpm的条件下孵育20小时。在接种培养过程中，不调整pH。在接种培养完成后，将每种接种培养物接种到发酵培养基中，并进行补料分批培养。通过将1.4升发酵培养基分发到5升实验室发酵罐中，然后在121℃下压力灭菌20分钟来制备发酵培养基。在发酵培养基冷却后，将200ml每种接种培养物接种到发酵培养基中，并在1vvm速率的通风、800rpm和40℃的条件下进行培养。在发酵过程中，向每种发酵培养物补充以葡萄糖补充培养基，以维持培养物中残余葡萄糖的水平为0.5-1％，直至发酵培养物中葡萄糖的总含量达到20％为止。在发酵过程中，使用含水氨将pH维持在7.0。发酵进行60-70小时。当发酵完成时，以与实施例1相同的方式测量积累在发酵培养物中的核黄素的浓度。在本实施例中使用的接种培养基和发酵培养基的每个组分示于表4。
表4适于在5升发酵罐中培养的培养基的组分
依照试验结果，作为亲株的枯草芽孢杆菌AS5生产22.4g/l核黄素。在另一方面，本发明的枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)生产26.8g/l核黄素，其比枯草芽孢杆菌AS5生产的核黄素高约19.6％。
从上述描述中显而易见，本发明的枯草芽孢杆菌对脯氨酸类似物具有高的抗性，并且在菌体内具有增加的脯氨酸合成，以获得增高的渗透压，导致以高产率生产高浓度的核黄素。因此，可大量生产核黄素。
权利要求
1.生产核黄素的枯草芽孢杆菌，其对脯氨酸类似物具有抗性。
2.依照权利要求1的枯草芽孢杆菌，其是枯草芽孢杆菌CJKB0001(KCCM-10445)。
3.一种生产核黄素的方法，包括培养依照权利要求1或2的枯草芽孢杆菌，并从培养物中回收核黄素。
全文摘要
抗脯氨酸类似物的生产核黄素的枯草芽孢杆菌，和一种利用提供的枯草芽孢杆菌生产核黄素的方法。
文档编号C12N1/20GK1504564SQ0314307
公开日2004年6月16日 申请日期2003年6月19日 优先权日2002年12月5日
发明者李光镐, 朴英薰, 韩锺权, 朴长熙, 李庚翰 申请人:Gj株式会社