专利名称：抑制sars冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗SARS冠状病毒药物，具体涉及抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类抗病毒药物。
背景技术：
SARS冠状病毒是引起2003年在我国和世界范围内爆发的“非典型肺炎”的病原体，目前还没有特效的药物能够治疗。
SARS病毒是一种带囊膜的冠状病毒，其侵染细胞的第一步就是病毒囊膜与宿主细胞的融合。多肽类融合阻断分子因其能够阻断病毒囊膜与宿主细胞的融合，在其他病毒药物的开发研制中有着成功的经验，如HIV囊膜蛋白GP41有两段HR结构域，分别形成三个N螺旋和三个C螺旋。在HIV侵入细胞的过程中，这三个N螺旋和三个C螺旋形成Coiled-coil六聚体结构起着至关重要的作用。根据这一原理设计的多肽类药物T-20(商品名Fuzeon)已经上市，它能够有效地阻断由GP41本身的α螺旋形成六聚体，从而阻断HIV膜结构和细胞膜的融合。研究表明，T-20的阻断能力强，对机体副作用低，是一种理想的药物。
SARS囊膜蛋白SPIKE的结构研究表明，在SPIKE蛋白中同样存在能够形成Coiled-coil结构的两段HR结构域。
发明内容
本发明的目的是开发一类阻断SARS冠状病毒进入宿主细胞的抗病毒药物。
本发明的技术方案是寻找可起到SARS冠状病毒多肽类融合阻断作用的物质，通过该物质与SARS囊膜蛋白Spike的相互作用，阻止SARS囊膜蛋白Spike的构型改变，从而阻断病毒囊膜与宿主细胞的融合，达到预防和治疗SARS病毒感染的目的。
本发明提供的SARS冠状病毒多肽类融合阻断药物的具有如下通式X-SEQ-Z其中，SEQ表示SARS冠状病毒囊膜蛋白SPIKE中的多肽，所述多肽包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列。
在SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列的多肽中至少一个氨基酸残基的连接使用非肽键连接方式，例如，以亚氨基、酯、肼、氨基脲或含氮化学键的形式连接；至少一个氨基酸残基以D构型存在；至少有一个氨基酸被另一个不同的氨基酸置换，所述置换方式是保守的和/或不保守的；所述多肽可以是SARS自然突变株相对应氨基酸位置的同源物；所述多肽可以被包含在一段其它多肽中；所述多肽可以以单体，二聚体，三聚体和多聚体的形式存在。
X包括氨基、乙酰基，及某些疏水基团和大分子载体基团；Z包括羧基、氨基及某些疏水基团和大分子载体基团；所述疏水基团包括9-芴基甲氧羰基(9-fluorenyl methoxy-carbonyl)、苄氧羰基(carbobenzoxyl)1-二甲胺基萘-5-磺酰(dansyl)和叔丁氧羰基(t-butyloxy carbonyl)；所述大分子载体基团是共轭脂肪酸(Lipid-fatty acid conjuate)、聚乙二醇或碳水化合物类基团。
上述通式中，X和Z也可以不存在。即，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列也可用作阻断SARS冠状病毒进入宿主细胞的抗病毒药物。
本发明所述的多肽可以从真核细胞表达系统、原核细胞表达系统或固相化学合成的途径得到。
在采用原核表达系统的实验中，先用PCR的方法扩增SARS囊膜蛋白SPIKE的一段序列，将其克隆到表达载体上。诱导表达后，使用GlutathioneSepharose 4B系统纯化得到多肽样品。
化学合成可选用本技术领域人工合成多肽的常规操作方法。
经药效学实验测试，本发明的多肽类药物对于SARS冠状病毒活病毒感染其易感细胞VeroE6具有阻断能力，表明本发明的多肽类药物可抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞。
具体实施例方式
本发明SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列所示的多肽中，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15采用原核表达系统得到，SEQ ID NO.16～21为人工合成得到。
实施例1大肠杆菌表达多肽1.SARS病毒样本的总RNA的提取(1)用1ml trizol(GIBCO)抽提含有SARS病毒样本；(2)加200μl氯仿，剧烈振荡15秒；(3)室温静置3-5min，10000g4℃离心15min；
(4)吸出500μl水相，转移到新管中；(5)加入500μl异丙醇，充分振荡混匀；室温静置10min(6)10000g4℃离心10min，得到SARS病毒RNA沉淀。
2.SARS病毒SPIKE蛋白基因的克隆(1)将SARS病毒RNA基因组反转录为DNA反转录引物SPIKE蛋白antisense primer反转录酶MMLV-RT(promega)(2)通过PCR方法扩增出SPIKE的DNA序列。
扩增引物Sense5’-cgggatccaacgaacatgtttattttcttattatttc-3’antisense5’-cggaattcgtttatgtgtaatgtaatttgacaccc-3’(3)将PCR产物连接到pcDNA3.1+载体中连接方式BamHI，EcoRI双切连接。
3.克隆得到下列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15的多肽的序列及其PCR引物如下SEQ ID NO.1NGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTAAATGGCATTGGAGTTACCTGC AGT TGA TGT TGT TGT AAGSEQ ID NO.2PDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQCCAGATGTTGATCTTGGCTTGAAGGTCAATGAGTGATTCSEQ ID NO.3GDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQGGCGACATTTCAGGCATTAACTTGAAGGTCAATGAGTGATTCSEQ ID NO.4ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTT CAG GCA TTA ACG CTT C
CCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.5INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWATTAACGCTTCTGTCGTCAACCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.6VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWG TCG TCA ACA TTC AAA AAGCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.7IQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTC AAA AAG AAA TTG ACC GCCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.8IDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTG ACC GCC TCA ATG AGG TCCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.9ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKA TTT CAG GCA TTA ACG CTT CTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.10INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKATTAACGCTTCTGTCGTCAACTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.11VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKG TCG TCA ACA TTC AAA AAGTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.12IQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKA TTC AAA AAG AAA TTG ACC GCTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.13ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
A TTT CAG GCA TTA ACG CTT CAAG GTC AAT GAG TGA TTC ASEQ ID NO.14INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLATTAACGCTTCTGTCGTCAACAAG GTC AAT GAG TGA TTC ASEQ ID NO.15VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLG TCG TCA ACA TTC AAA AAGAAG GTC AAT GAG TGA TTC A4，多肽的表达(1)将PCR产物回收纯化后连接到pGEX-6p-2载体(Amersham Pharmacia Biotech.27-4598-01)的sma I切点。
(2)将正确构建的重组质粒转入到JM109(DE3)感受态细胞中，用含抗生素的LB培养基过夜培养。
(3)过夜培养物1∶50接400ml新鲜培养基，2小时后加80ml 1M IPTG诱导，继续培养4小时。
(4)4℃，8000rpm 6min离心培养的细菌，加入15ml Lysis Buffer重悬沉淀，加入溶菌酶至终浓度为100mg/ml，置冰上30min，冰上超声12次(300W，10s/10s)(5)4℃，12000rpm离心15min，取上清以5-10mgGST/ml的比例加入Glutathione Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech.17-0756-01)，在冰上结合1h，使样品液过层析柱(Bio-Rad 74306)使用5倍体积的Hepes500洗涤GST柱子，之后使用10倍体积的Hepes100洗涤，再用0.5ml含10mMGSH的Hepes100洗涤柱料4次，收集流出液。
(6)在酶切Buffer终透析过夜，除去GSH，使用分光光度计定量(1OD280＝0.5mg/ml)，按照每100mg加入1ml(2units)preScissionProtease(Amersham Pharmacia Biotech.27-0843-01)，4℃酶切3h。以5-10mg GST/ml的比例加入Glutathione Sepharose 4B(Amersham PharmaciaBiotech.17-0756-01)，在冰上结合1h，使样品液过层析柱(Bio-Rad74306)，收集流出液，使用0.5ml酶切Buffer再洗一次，收集流出液。
实施例2多肽抑制SARS病毒感染靶细胞实验一、实验材料及方法1病毒的获取和培养取含有SARS病毒的上清加到长成单层的VeroE6细胞上，37℃感染1小时，加入DMEM+2％FBS，继续于37℃培养观察CPE，待CPE完全时收获上清。
2病毒滴度的测定将病毒上清连续稀释，将只有一半细胞样品出现CPE，而下一个稀释度没有CPE的稀释度定为最大稀释度。
3测定多肽对病毒的抑制活性每份测试细胞加入多肽样品终浓度1μM，加入病毒200TCID50，24小时后观察CPE判断细胞是否被感染。
二、实验结果所观察到CPE细胞未被感染，证明受试多肽可阻断SARS冠状病毒进入宿主细胞。
序列表<110>北京大学<120>抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类药物<130>03-01<160>19<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>38<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>1Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln1 5 10 15Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu20 25 30Thr Thr Thr Ser Thr Ala35<210>2<211>40<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>2Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val1 5 10 15Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu20 25 30Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln
35 40<210>3<211>35<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>3Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu1 5 10 15Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile20 25 30Asp Leu Gln35<210>4<211>46<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>4Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25 30Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp35 40 45<210>5
<211>43<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>5Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn1 5 10 15Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu20 25 30Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp35 40<210>6<211>39<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>6Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys1 5 10 15Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu20 25 30Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp35<2l0>7<211>36<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>7Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn
1 5 10 15Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile20 25 30Lys Trp Pro Trp35<210>8<211>32<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>8Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile1 5 10 15Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp20 25 30<210>9<211>37<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>9Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25 30Gln Glu Leu Gly Lys35
<210>10<211>34<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>10Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn1 5 10 15Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu20 25 30Gly Lys<210>11<211>30<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>11Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys1 5 10 15Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys20 25 30<210>12<211>27<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>12Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn1 5 10 15Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys20 25
<210>13<211>32<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>13Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25 30<210>14<211>29<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>14Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn1 5 10 15Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25<210>15<211>25<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>15Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys1 5 10 15
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25<210>16<211>35<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>16Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys1 5 10 15Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu20 25 30Ile Asp Leu35<210>17<211>35<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>17Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu1 5 10 15Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys20 25 30Trp Pro Trp35<210>18<211>36
<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>18Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val1 5 10 15Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu20 25 30Ala Ala Thr Lys35<210>19<211>36<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>19Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn1 5 10 15Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala20 25 30Leu Gly Lys Leu35<210>20<211>35<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>20Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys1 5 10 15
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu20 25 30Gln Tyr Ile35<210>21<211>35<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>21Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25 30Gln Glu Leu3权利要求
1.抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类药物，具有如下通式X-SEQ-Z式中，SEQ表示SARS冠状病毒囊膜蛋白SPIKE中的多肽，所述多肽包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列；X包括氨基、乙酰基及疏水基团和大分子载体基团；Z包括羧基、氨基及疏水基团和大分子载体基团。
2.权利要求1所述的多肽类药物，其中所述多肽的至少一个氨基酸残基的连接使用非肽键连接方式；所述非肽键连接方式包括以亚氨基、酯、肼、氨基脲或含氮化学键的形式连接。
3.权利要求1所述的多肽类药物，其中所述多肽的至少一个氨基酸残基以D构型存在。
4.权利要求1所述的多肽类药物，其中所述多肽的至少一个氨基酸被另一个不同的氨基酸置换，所述置换方式是保守的和/或不保守的。
5.权利要求1所述的多肽类药物，其中所述多肽是SARS自然突变株相对应氨基酸位置的同源物。
6.权利要求1所述的多肽类药物，其中所述多肽被包含在一段其它多肽中。
7.权利要求1所述的多肽类药物，其中所述多肽的形式包括单体、二聚体、三聚体和多聚体。
8.权利要求1所述的多肽类药物在制备预防和治疗SARS冠状病毒药物中的用途。
9.具有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的多肽。
10.权利要求9所述的多肽在制备预防和治疗SARS冠状病毒药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类抗病毒药物，所述药物的通式为X－SEQ－Z，其中SEQ表示SEQ ID NO.1～SEQ ID N0.21所示的21个氨基酸序列。经药效学实验测试，本发明的多肽类药物可抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞。
文档编号C12N15/63GK1566142SQ0314303
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月12日 优先权日2003年6月12日
发明者邓宏魁, 丁明孝, 袁克湖, 庆婷婷, 陈坚, 熊梓锴, 聂玉春, 王在, 易凌, 江鹏飞, 任立晨 申请人:北京大学